ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 449-454
УДК 581.1
АУКСИН И ФЛАВОНОИДЫ В ПРОГАМНОЙ ФАЗЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ПЕТУНИИ
© 2007 г. Л. В. Ковалева, Е. В. Захарова, Ю. В. Минкина
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 25.07.2006 г.
На двух клонах петунии (Petunia hybrida L.) - самосовместимом и самонесовместимом - исследовали динамику содержания ИУК и флавоноидов (Фл) в развивающихся пыльниках, прорастающих in vitro пыльцевых трубках и системе пыльца-пестик in vivo. Развитие мужских гаметофитов обоих клонов сопровождалось повышением содержания ИУК (от 10 до 60-70 нг/г сырой массы) и накоплением Фл (от 2 до 20 мг/г сырой массы). При прорастании in vitro мужского гаметофита обоих клонов значительно (на 15-30%) повышалось содержание ИУК в течение первых двух часов и Фл в течение первого часа. Экзогенные ИУК и Фл стимулировали на 25-30% как прорастание пыльцевых зерен, так и рост in vitro пыльцевых трубок. Прорастание мужского гаметофита in vivo на поверхности рыльца пестика (после самосовместимого и самонесовместимого опыления) сопровождалось повышением уровня ИУК в течение 8 ч от 90 до 160-200 нг/г сырой массы, а содержание Фл - от 2 до 3 мг/г сырой массы в течение первого часа и далее сохранялось на этом уровне. В системе пыльца-пестик ИУК и Фл были распределены равномерно в тканях рыльца, столбика и завязи. Полученные результаты послужили основанием для вывода о том, что Фл могут быть эндогенными регуляторами транспорта ИУК - одного из основных факторов регуляции роста и развития мужского гаметофита в прогамной фазе оплодотворения, но не участвуют в механизме гаметофитной самонесовместимости.
Petunia hybrida - мужской гаметофит - прорастание и рост in vitro и in vivo - ИУК - флавоноиды
ВВЕДЕНИЕ
Прорастание и рост мужского гаметофита в прогамной фазе оплодотворения требуют пространственной и временной координации многих клеточных функций, включая ионные потоки, организацию и динамику элементов цитоскелета, траффик везикул, экзоцитоз и эндоцитоз. Регуля-торные механизмы гаметофитно-спорофитных взаимодействий, контролирующих эту сложную цепь событий в системе пыльца-пестик, пока не установлены, хотя и активно исследуются [1]. В частности, получены данные об участии гормонов в регуляции межклеточных взаимодействий при прорастании пыльцы на поверхности рыльца и росте пыльцевых трубок в проводниковых тканях столбика петунии [2].
Участие флавоноидов (Фл) в репродуктивном процессе у растений неоднократно обнаруживалось во многих исследованиях [3-10]. Трансгенные растения петунии, дефицитные по гену хал-
Сокращение: Фл - флавоноиды.
Адрес для корреспонденции: Ковалева Лидия Валентиновна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронный адрес: kovaleva_l@mail.ru
консинтазы (одного из ферментов биосинтеза Фл), обладали мужской стерильностью [1]. Продуцируемые пыльником табака Фл (кверцетин и кемпферол) стимулировали прорастание пыльцевых зерен и рост пыльцевых трубок in vitro и образование семян [7]. Тем не менее, функции Фл в этих процессах остаются неясными. Следует отметить, что полученные на различных объектах экспериментальные данные о Фл неоднозначны. Так, флавоноид-дефицитные мутанты петунии и кукурузы производили стерильную пыльцу [3, 8], что позволило авторам сделать вывод о причастности Фл к фертильности мужского гаметофита. Однако по другим данным, пыльца подобных мутантов арабидопсиса прорастала на рыльце фер-тильных клонов [11, 12], что свидетельствует не в пользу универсальности сделанного заключения.
В последние годы накапливаются данные о Фл как сигнальных молекулах, участвующих в различных процессах роста и развития растений [13, 14]. Локализация ферментов биосинтеза Фл (хал-консинтазы и халконизомеразы) как в ядре, так и в цитоплазме позволила авторам предположить участие Фл в регуляции генной транскрипции на субклеточном уровне [13]. Полагают, что Фл могут участвовать в ингибировании сигнальных каскадов фосфорилирования или специфических ки-
наз. Согласно данным Benjamins с соавт. [15], PID-киназа участвует в полярном транспорте ауксина и взаимодействует с Са2+-связывающими белками. Анализ PIN-белков и транспорта ауксина у флавоноид-дефицитных мутантов предполагает, что PID-медиируемая киназная активность может модулироваться эндогенными Фл [16]. У Arabi-dopsis thaliana накопление Фл отмечено в областях, где экспрессируются белки AtPTENl (специфический для пыльцы белок), PID и RCN1 (специфический для корней белок) [15, 17].
Согласно литературным данным [18, 19], совместная локализация Фл и ИУК в различных органах растений может свидетельствовать об участии Фл в регуляции транспорта ИУК. Целью данного исследования была проверка гипотезы о том, могут ли Фл быть эндогенными регуляторами транспорта ИУК в процессе формирования, прорастания и роста мужского гаметофита. Для этого определяли динамику содержания ИУК и Фл в спорофитных тканях пыльника, в тесном взаимодействии с которыми происходит развитие мужского гаметофита, в прорастающей in vitro зрелой пыльце и системе in vivo пыльца-пестик у петунии двух клонов (самосовместимого и самонесовместимого), поскольку какие-либо сведения об участии Фл в механизме самонесовместимости также отсутствуют.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили растения двух клонов петунии (Petunia hybrida L., совместимый и несовместимый клоны), выращенные в почвенной культуре при естественном освещении в оранжерее. В работе использовали пыльники из развивающихся бутонов (длиной 1.5, 2.0, 3.0, 4.5 и 5.0 см), зрелую пыльцу, прорастающую in vitro пыльцу, а также опыленный пестик и отдельные его части (рыльце, столбик и завязь) in vivo после совместимого и несовместимого опыления.
Пыльцевые трубки культивировали в термостатированных условиях при 25-26°С на среде, содержавшей 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ борную кислоту. О степени прорастания пыльцевых зерен судили по количеству проросших в течение 6 ч наблюдаемых в четырех полях микроскопа пыльцевых зерен (n = 200). Длину растущих пыльцевых трубок измеряли с помощью микроскопа с окуляр-микрометром при 150-кратном увеличении. В каждом варианте опыта оценивали длину 100 проросших пыльцевых трубок в 6 биологических повторностях.
Эффекты действия экзогенных Фл на прорастание пыльцевых зерен и рост пыльцевых трубок in vitro исследовали на образцах пыльцы, собранной со зрелых цветков петунии самосовместимого и самонесовместимого клонов.
Свежесобранную пыльцу (10 мг) проращивали в течение 6 ч при 25-26°С на среде, содержавшей 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ борную кислоту, затем промывали дистиллированной водой и фиксировали 70%-ным этанолом. Навески (50-150 мг) пестиков (а также рылец, столбиков и завязей) также фиксировали 70%-ным этанолом. Содержание Фл определяли спектрофотометрически с хлористым алюминием (поглощение при 415 нм), согласно методике [20, 21].
Содержание ИУК определяли методом ВЭЖХ [22]. Образцы (1-5 г) фиксировали жидким азотом, лиофильно высушивали и анализировали. Условия хроматографирования: детектор флуоресцентный RF-530 ("Shimadzu", Япония); колонка - Ultrapac Column Lichrosorb RP (18.5 мкм, 4 x 250 мм, Швеция); элюент - 40%-ный метанол, скорость протекания - 0.3 мл/мин, время удерживания - 5 мин. Идентификацию ИУК проводили, сравнивая время удерживания в образце и стандартной ИУК ("Sigma", США). Минимальная регистрируемая концентрация ИУК составляла 250 пкг в аликвоте пробы (20 мкл).
В таблице и на рис. 1 и 2 (нижний ряд) приведены средние арифметические и их стандартные ошибки из 3-5 независимых опытов, каждый из которых проведен в 2-кратной биологической по-вторности. Достоверность различий между вариантами оценивали по /-критерию Стьюдента при уровне значимости P < 0.05. На рис. 1 и 2 (верхний ряд) приведены средние арифметические из двух биологических повторностей (каждая состояла из 50 пестиков, 100 рылец, 100 столбиков или 100 завязей, собранных с 20 растений) и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Формирование пыльцевых зерен самосовместимого и самонесовместимого клонов сопровождалось постепенным увеличением содержания ИУК и Фл в развивающихся пыльниках (рис. 1). Зрелая пыльца содержала 60-70 нг ИУК/г сырой массы и 20 мг Фл/г сырой массы. Зрелый мужской гаметофит (пыльца) и неопыленные пестики содержали примерно одинаковое количество ИУК, но различались по уровню Фл: по сравнению с мужским гаметофитом спорофитные ткани пестика характеризовались в 10 раз более низким содержанием Фл (рис. 1).
В прорастающих in vitro мужских гаметофитах обоих клонов отмечено повышение уровня ИУК в течение 2 ч культивирования, в то время как повышение содержания Фл наблюдали только в течение первого часа прорастания (рис. 1).
Динамика содержания ИУК и Фл при прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок in vivo, в проводниковых тканях пестика, была несколь-
Пыльник-мужской гаметофит
80 г
« ей £ «60 § S
¡S £40
* й & °
g -Ъ. 20
и и
о й
О
0
25
А« 20 ^ Я
« rs
10
Пыльники из бутонов Зрелая 2-3 см 5 см пыльца
к
J&J
т л №
Пыльники из бутонов 1.5 см 2.0 см 3.0 см 4.5 см 5.0 см
Растущие in vitro пыльцевые трубки 60 г 220
40
20
0
Пыльца-пестик
Зрелая пыльца
024 Время культивирования, ч
0 4 8 Время после опыления, ч
40
т 35
30
25
20
15
10
5
0
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Время культивирования, ч
10 8 6 4 2 0
j_I_I_I_I_I_
0 1 2 34 5 6 Время после опыления, ч
Рис. 1. Содержание ИУК и Фл в системах: пыльник-мужской гаметофит, прорастающие in vitro пыльцевые трубки, пыльца-пестик петунии двух клонов. 1 - самосовместимый, 2 - самонесовместимый клон.
1
5
0
ко иной (рис. 1). Прорастание мужского гаметофита на воспринимающей поверхности рыльца в течение 1-2 ч (данные не представлены), так же как и in vitro, сопровождалось постепенным повышением уровней ИУК и Фл. Однако дальнейший рост пыльцевых трубок в тканях рыльца (от 2 до 4 ч после опыления), а затем и в тканях столбика (от 4 до 8 ч после опыления) сопровождался повышением уровня только ИУК при сохранении мало меняю
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.