МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 6, с. 814-822
УДК 582.232:553.78(571.531.55)
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
АЗОТФИКСИРУЮЩАЯ ЦИАНОБАКТЕРИЯ TRICHORMUS VARIABILIS ИЗ ФИТОПЛАНКТОНА ОЗЕРА БАЙКАЛ
© 2008 г. А. С. Гладких1, О. И. Белых, И. В. Клименков, И. В. Тихонова
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск Поступила в редакцию 28.09.2007 г.
Из пелагиали озера Байкал был выделен новый штамм нитчатой цианобактерии BAC 9610. С использованием методов световой, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, а также данных анализа последовательности гена 16S рРНК цианобактерия идентифицирована как Trichormus variabilis, известный ранее как Anabaena variabilis. Trichormus - новый для Байкала род цианобактерий, который отсутствует в списке байкальских планктонных водорослей, вид A. variabilis также ранее не отмечался в составе байкальского фитопланктона. Экспериментально продемонстрирована способность T. variabilis к фиксации атмосферного азота, с помощью ПЦР выявлен nifH ген, ответственный за азотфиксацию, и проанализирован участок его последовательности. Гены синтеза гепатотоксинов в полученном штамме не обнаружены.
Ключевые слова: цианобактерии, азотфиксация, Trichormus variabilis, токсины, 16S рРНК ген, nifH ген.
Цианобактерии, ранее известные как синезеле-ные водоросли, - очень древняя и широко распространенная в природе группа прокариот. Они обладают способностью сочетать два важнейших процесса в биосфере: фотосинтез с выделением кислорода и азотфиксацию. Молекулярный азот способны восстанавливать нитчатые цианобактерии, имеющие специализированные клетки - гете-роцисты, в которых находится нитрогеназа - основной фермент азотфиксации. Нитрогеназа представляет собой бинарный металлопротеин (Mo-Fe-белок), который благодаря энергии фотосинтеза может связывать молекулярный азот и восстанавливать его до аммиака. Фермент входит в состав нитрогеназного комплекса, второй компонент которого - это Fe-белок (редуктаза нитрогеназы), его функция - снабжать нитрогеназу "низкопотенциальными" электронами. Азотфиксирующей активностью обладает лишь комплекс из обоих компонентов. Редуктаза нитрогеназы кодируется nifH-ге-ном, за синтез нитрогеназы ответственны два гена: nifD и nifK. Выявление генов азотфиксации, в частности mfH-генов, помогло обнаружить целый ряд потенциальных диазотрофов, включая цианобактерии, протеобактерии, анаэробные бактерии, в различных экосистемах [1, 2].
В пресных водоемах цианобактерии являются одними из основных планктонных азотфиксаторов, эта способность дает им значительное конкурентное преимущество в случае недостатка азота [3].
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: gladkikh@lin.irk.ru).
Наиболее известными являются представители родов Anabaena Bory, Aphanizomenon Morren, Gloecapsa (Kütz.) Hollerb., Nostoc Vauch. ex Born. et Flah., Oscilla-toria Vauch., Trichormus Rales ex Born. et Flah.
В списке байкальских планктонных водорослей [4] указаны представители нескольких родов цианобактерий, известных в других водоемах в качестве азотфиксаторов. В работах, посвященных фитопланктону оз. Байкал, показано, что цианобактерии достигают значительного видового разнообразия и высокой численности как в пелагиали, так и в мелководных районах, особенно в летний период [5, 6]. Однако, несмотря на значительную роль цианобактерий в экосистеме озера, задача изучения азотфиксации ранее специально не ставилась.
Нередко именно виды-азотфиксаторы при массовом развитии становятся причиной "цветения" водоемов. При этом цианобактерии часто синтезируют токсины, что вызывает реальную угрозу для жизни и здоровья людей и животных. В настоящее время известно большое количество цианотокси-нов, среди них наиболее известными и изученными являются гепатотоксины. Молекулярно-биологи-ческая детекция генов синтеза цианотоксинов позволила выявить токсичные цианобактерии во многих водоемах мира. В водохранилищах Байкальского региона с помощью генетических маркеров мы показали присутствие цианобактерий, способных синтезировать гепатотоксины, в Байкале токсичные штаммы не были обнаружены, хотя в фито-
планктоне озера выявлены потенциально токсичные виды [7].
Целью работы было определение систематического положения выделенного из пелагиали озера Байкал нового штамма цианобактерий с помощью методов микроскопии и анализа последовательности гена 16S рРНК, изучение его способности к азотфиксации и синтезу токсинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для выделения культуры в августе 2005 г. в пелагиали Южного Байкала в слое 0-25 м были отобраны планктонные пробы. Накопительные культуры выращивали на жидкой минеральной среде Z8 [8]. Выделение чистой культуры проводили путем многократного пересева на агаризованную среду Z8. Культура содержалась в инкубаторе New Brunswick G25 ("New Brunswick Scientific", США) со световым режимом: 14 ч свет (интенсивность 750 лк) и 10 ч темнота, при температуре 12°С. Выделенный штамм хранится в коллекции цианобактерий и водорослей Лимнологического института СО РАН под номером BAC 9610.
Эксперименты по изучению влияния различной освещенности и перемешивания на ростовые характеристики выделенного штамма проводили на среде Z8. В качестве контроля использовали штамм пикопланктонной цианобактерии Synechococcus sp. ВАС 98111 из коллекции ЛИН СО РАН. Для определения способности к азотфиксации проводили эксперименты на среде Z8 без добавления нитратов. Динамику роста культур оценивали по изменению оптической плотности на спектрофотометре CФ-46 ("Ломо", Россия) при длине волны 700 нм; измерения проводили с интервалом в трое суток.
Для изучения морфологии и пигментных характеристик нефиксированные клетки наблюдали в световой микроскоп Axiovert 200 ("Zeiss", Германия), снабженный ртутной лампой HBO 50 и тремя наборами фильтров: G 365, BP 450-490, BP 546/12. Микрофотографии получали камерой Penguin 600CL ("Pixera Corp.", США) в программе ВидеоТест-Размер 5.0 (www.videotest.ru). С помощью этой же программы проводили измерение клеток и статистическую обработку результатов.
Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) клетки фиксировали глутаровым альдегидом (1% конечная концентрация), помещали на поликарбонатные фильтры "Millipore" с диаметром пор 0.2 мкм и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. После высушивания в критической точке (Balzers CPD 030 Critical Point Dryer, "Bal-Tec AG", Лихтенштейн) препараты напыляли золотом (Balzers SCD 004) и наблюдали в сканирующий электронный микроскоп Philips SEM 525M ("Philips", Голландия). Микрофотографии получали с
помощью системы электронного сканирования изображения (ЛИН СО РАН).
Клетки для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) фиксировали в 1% глутаровом альдегиде и 0.25% OsO4 на 0.1 М какодилатном буфере. Далее образцы постфиксировали 1% OsO4 и дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и 100% ацетоне, после чего заключали в эпон-аралдит и полимеризовали. Ультратонкие срезы получали на микротоме Ultracut К ("Leika Microsystems", Германия). Окрашивание срезов проводили уранил-ацетатом и цитратом свинца по методу Pейнольдса [9]. Срезы наблюдали в электронный микроскоп Leo 906E ("Zeiss", Германия). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры MegaView II ("LEO Elektronenmikroskopie GmbH", Германия) и программного обеспечения MegaVision ("Soft Imaging System GmbH", Германия).
ДНК выделяли методом адсорбции на силика-геле с использованием набора РибоСорб ("ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора", Россия) по инструкции производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе Mini Cycler MJ Research, ("Bio-Rad", США) с применением реагентов фирмы "Амплисенс" (ЦНИИ эпидемиологии, Москва) в объеме 15 мкл (объем ДНК 1 мкл, концентрация 200-300 нг). Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с использованием специфичных для цианобактерий праймеров 106F и 781R (a) [10], соответствующих позициям 106127 и 781-805 E. coli. Реакцию проводили по следующей программе: 94°С - 5 мин, далее 35 циклов: 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин 10 с, этап завершающего синтеза - 72°С - 10 мин. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК зеленой водоросли Choricystis sp. ВАС 9708. Для амплификации последовательностей nifH гена использовали праймеры С№ и CNR [1], cконструированные специально для цианобактерий. Параметры ПЦР были следующие: 95°С - 10 мин, далее 30 циклов: 95°С - 1 мин, 57°С - 30 с, 72°С - 40 с, и этап завершающего синтеза 72°С - 6 мин. В отрицательной контрольной реакции использовали ДНК штамма Synechococcus sp. ВАС 98111.
Для выявления генов синтеза гепатотоксинов (микроцистины и нодуларины) использовали универсальные праймеры HepF и HepR [11]. Реакцию проводили по следующей программе: 2 мин - 92°С и далее 35 циклов: 92°С - 20 с, 52°С - 30 с, 72°С -1 мин, в последнем цикле этап элонгации удлинен до 6 мин. В положительной контрольной реакции использовали ДНК токсичного штамма Microcystis aeruginosa CALU 972, любезно предоставленного Л.Н. Волошко (БИН, С.-Петербург), в отрицательной контрольной реакции - ДНК штамма Synecho-coccus sp. ВАС 98111.
Анализ полученных ПЦР-продуктов проводили с помощью горизонтального электрофореза в 1%
Рис. 1. Световая (а) и cканирующая электронная микроскопия (б) цианобактерии T. variabilis BAC 9610: тр - трихомы, г - гетероцисты. Масштаб: а - 50 мкм; б - 10 мкм.
агарозном геле с использованием 0.5% TAE буфера (20 мM трис-GH, 0.5 мM ЭДТА, 7.8 мM CH3CGGH, pH 7.6). Для визуализации применяли бромистый этидий. B качестве маркера молекулярного веса использовали Д^ИХ фага X, обработанную рестрикта-зой PstI ("СибЭнзим", Hoвoсибиpск). Полосы ДHK вырезали из геля стерильным скальпелем и помещали в микропробирки.
ПЦP-пpoдукты элюировали методом заморозки-оттаивания с последующим центрифугированием. Анализ чистоты и концентрации продукта осуществляли в агарозном геле. Определение нуклео-тидных последовательностей проводили на секвена-торе Beckman CEQtm 8800 ("Beckman Coulter Inc.", США). Полученные хроматограммы обрабатывали программой Chromas (www.technelysium.com.au/chro-mas.html). Hуклeoтидныe последовательнос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.