ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 279-288
УДК 579.81.017.6: 557.152.1
АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ - ПРОДУЦЕНТЫ
ВОДОРОДА (ОБЗОР)
© 2007 г. A.A. Цыганков
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, 142290
ttt@issp .serpukhov .su Поступила в редакцию 6.07.2006 г.
В обзоре суммированы последние данные по ключевым ферментам, участвующим в выделении водорода, рассмотрено выделение водорода цианобактериями за счет действия нитрогеназы и гидрогена-зы и показана практическая значимость цианобактерий как преобразователей солнечной энергии в молекулярный водород как топливо. Обсуждаются необходимые, с точки зрения автора, направления дальнейших исследований.
В настоящее время в связи с ростом цен на нефть, а также негативным воздействием продуктов сгорания ископаемых топлив на климат, усиливается интерес к нетрадиционным источникам энергии. Молекулярный водород является одним из лучших экологически чистых энергоносителей для грядущей энергетики, поскольку продуктом его сгорания является вода. Для использования водорода в качестве топлива в промышленности необходимо решить ряд проблем, в частности разработать экологически чистые способы получения водорода.
Одним из возможных путей получения водорода без загрязнения окружающей среды является биологическое преобразование солнечной энергии. Азотфиксирующие цианобактерии, наряду с зелеными водорослями, рассматриваются в качестве потенциального элемента систем биоконверсии солнечной энергии. Важной особенностью цианобактерий является то, что они для выделения водорода используют воду, осуществляя ее непрямой фотолиз. В последние годы значительные успехи достигнуты в изучении разных аспектов этой проблемы. Появились обзоры, посвященные структуре, механизму действия и регуляции азотфиксации [1-6], метаболизму водорода у цианобактерий [7, 8], структурных генов гидрогеназ и регуляции их экспрессии [9], а также сводке данных по подбору условий для эффективного выделения водорода [7, 10]. Однако в российской научной литературе эти исследования практически не нашли отражения.
Предлагаемый краткий обзор суммирует последние данные по метаболизму водорода у цианобактерий. Обсуждаются необходимые, с точки зрения автора, направления дальнейших исследований с целью повышения скорости выделения водорода цианобактериями до практически важных значений.
ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ВЫДЕЛЕНИИ ВОДОРОДА
Нитрогеназы (КФ 1.18.6.1). Азотфиксирующие цианобактерии способны синтезировать несколько типов нитрогеназ, различающихся по металлам, входящим в активный центр. Наиболее изученной является Мо-нитрогеназа [11, 12]. Это двухкомпонентный металлоферментный комплекс, кодируемый «т/НБК-генами (продукты этих генов называют у-, а- и ^-белками, соответственно), состоящий из гетеротетрамерной нитрогеназы (Мо-Бе-белка, а^) и гомодимерной редуктазы нитрогеназы (Бе-белка, у2). Каждая а0-субъеди-ница Мо-Бе-белка содержит Бе-Мо-кофактор (Ре789Мо-гомоцитрат), расположенный внутри а-субъединицы, и Р-кластер, расположенный на границе между а- и ^-белками. Считается, что Бе-Мо-кофактор является центром связывания молекулярного азота. Бе-белок содержит один 4Бе48 кластер, расположенный между субъединицами, и два центра связывания нуклеотидов, выполняя АТФ-зависимый перенос электронов к самой нитрогеназе. Синтез и созревание нитроге-назного ферментного комплекса происходит при участии большого количества продуктов вспомогательных генов и подвержен очень сложной регуляции [1]. Следует лишь отметить, что синтез Мо-нитрогеназ репрессируется связанными формами азота, избытком кислорода и требует наличия молибдена [13].
В физиологических условиях Мо-нитрогеназа катализирует реакцию азотфиксации:
N + 8Н+ + 8е + 16АТФ = 21Ж3 + 16АДФ + 16Р; + Н2(1)
Следует отметить, что выделение 1 молекулы водорода при фиксации 1 молекулы азота происходит лишь в оптимальных условиях. При недостатке азота водород выделяется с большей скоростью. Так, азотфиксирующие пурпурные бак-
терии Rhodobacter capsulatus при избытке азота (58-95 Па в газовой фазе) на 1 молекулу фиксированного азота выделяли 0.8-0.9 молекул водорода, тогда как при лимитировании азотом на одну молекулу азота выделялось до 5 молекул водорода [14]. При полном отсутствии азота скорость выделения водорода примерно равна скорости азотфиксации (измеренная по скорости ацети-ленредукции) [11]. На этом факте и основаны все попытки использования азотфиксирующих фо-тосинтезирующих микроорганизмов в системах преобразования солнечной энергии.
Нитрогеназа очень чувствительна к действию молекулярного кислорода: бесклеточные экстракты, содержащие нитрогеназу, полностью теряют свою активность после нескольких секунд пребывания на воздухе. Поэтому цианобактерии выработали разные способы защиты нитрогеназы от кислорода. Гетероцистные цианобактерии имеют несколько механизмов защиты [15]. В аэробных условиях нитрогеназа локализована в гетероцистах, специализированных клетках, осуществляющих аноксигенный тип фотосинтеза (пространственное разделение) и имеющих внешнюю оболочку увеличенной толщины (пониженная скорость диффузии кислорода внутрь), а также наличие повышенной скорости дыхания в самом гетероцисте.
Долгое время считалось, что у гетероцистных цианобактерий Мо-нитрогеназа синтезируется только в гетероцистах. Для этого в гене nifD имеется вставка (11 кб у Anabaena PCC7120 и 24 кб у Nostoc punctioforme), удаляемая при формировании гетероциста под управлением xisA, находящегося в этой вставке [16] и не позволяющая синтезировать нитрогеназу в вегетативных клетках. Однако установлено, что ряд гетероцистных цианобактерий имеют дополнительную копию структурных генов Мо-нитрогеназы, которая синтезируется в вегетативных клетках, но только в анаэробных условиях [17].
У азотфиксирующих одноклеточных цианобактерий, а также у филаментных безгетероцистных форм Мо-нитрогеназа синтезируется в вегетативных клетках, но функционирует только в анаэробных и микроаэробных условиях [18], причем у ряда видов, в частности, у Synechococcus sp, процессы азотфиксации и фотосинтеза разнесены во времени клеточного цикла [19].
Наряду с Мо-нитрогеназами у цианобактерий обнаружены и нитрогеназы, не содержащие в своем активном центре Мо. Показано, что Anabaena variabilis [20] и Anabaena azollae [21] способны синтезировать еще 2 типа нитрогеназ: ванадий-содержащую и не содержащую ни молибден, ни ванадий. Синтез ванадиевой нитрогеназы (vnfHDGK) у цианобактерий, как у азотобактеров Azotobacter chroococcum и Azotobacter vinelandii [22], происходит в условиях недостатка связанных форм азота
и при отсутствии молибдена, когда Мо-нитроге-наза не синтезируется [23]. Следует отметить, что способность к синтезу альтернативных нитрогеназ обнаружена лишь у ряда видов азотобактера, пурпурных бактерий и некоторых гетероцистных цианобактерий, но не у представителей родов Rhizobium, Brhadyrhizobium или Pseudomonas [24]. Структурные гены ванадиевой нитрогеназы клонированы и секвенированы у A. vinelandii, A. chroococcum [22], и у цианобактерии A. variabilis [25]. Сведения о наличии генов альтернативных нитрогеназ у других цианобактерий пока отсутствуют [26].
Структурные гены vnfD и vnfK V-Fe-белка A. variabilis имеют высокую степень гомологии с аналогичными генами Az. chroococcum [25]. В отличие от Мо^е-белков Мо-нитрогеназ, V-Fe-белок ванадиевой нитрогеназы содержит, наряду с а- и ß-субъединицами, еще и 2 5-субъединицы (ген vn-fG), то есть является гетерогексамером [12].
Нитрогеназа, не содержащая молибдена и ванадия (Fe-нитрогеназа), также является гетерогексамером. Структурные гены этой нитрогеназы (anfHDGK) клонированы и секвенированы у Clostridium pausterianum [27], Rb. capsulatus [28] и A. vinelandii [29]. Несмотря на то, что описаны физиологические данные, свидетельствующие о синтезе этой нитрогеназы A. variabilis [30], геном этой цианобактерии не содержит anf-генов [26]; anfDK из разных организмов проявляют высокую степень гомологии, а также гомологичны (до 55%) vnfDK-генам [12]. Обнаружено, что аминокислотные остатки, ответственные за связывание Fe-Мо-кофактора и P-кластера в Mo-Fe-нитрогена-зе, имеются и у альтернативных нитрогеназ [12].
Стехиометрию действия V- и Fe-нитрогеназ для цианобактерий не изучали. Отмечено лишь, что соотношение скоростей выделения водорода и ацетиленредукции цианобактерий выше, когда культуры синтезировали ванадиевую, а не Мо-нитрогеназу [20, 23]. На основании данных, полученных на чистых ферментах ванадиевых нитрогеназ, выделенных из Az. vinelandii, сделано предположение, что эта нитрогеназа осуществляет реакцию азотфиксации согласно следующему уравнению [12]:
N2 + 12H+ + 12e + 40АТФ = 2NH3 + 2 3 (2) +40АДФ + 40Pj + 3H2
Вместе с тем, эта нитрогеназа обладает повышенным KM к N2, что может объяснять ее низкую энергоэффективность. Для Fe-нитрогеназы Rb. capsulatus показано, что растущие при высоком парциальном давлении культуры выделяли примерно 1Н2 на 1N2 [14], тогда как при снижении содержания азота в газовой фазе это соотношение достигало 50. Несмотря на то, что чистые ферменты и клетки микроорганизмов, содержа-
щие Бе-нитрогеназу, выделяли водород с большей скоростью, чем фиксировали азот, разработана модель ее функционирования в соответствии с уравнением (1), которая удовлетворительно описывает экспериментальные данные [31].
Удельная скорость азотфиксации одной и той же культурой была максимальна при наличии в клетках Мо-Бе-нитрогеназы, несколько ниже с У-Бе-нитрогеназой и минимальны с Бе-нитроге-назой. В то же время скорость выделения водорода клетками с Мо-Бе- и У-Бе-нитрогеназами примерно равна и выше, чем с Бе-нитрогеназой [12].
Гидрогеназы (КФ 1.12). К настоящему времени выделено в чистом виде и охарактеризовано несколько десятков гидрогеназ из самых разных микроорганизмов. Более сотни гидрогеназ охарактеризовано на основании их структурных генов. На основании наличия металлов в активном центре гидрогеназы подразделяют на Бе-№-, Бе- и гидрогеназы без металлосерного кластера [32]. Даже внутри такого подразделения гидрогеназы характер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.