УДК 571.27
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ЛИПОПОЛИСАХАРИД АКТИВИРУЕТ CD57-НЕГАГИВНЫЕ NK-КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА
© 2014 Л.М. Каневский1, С.А. Ерохина12, М.А. Стрельцова1, У.Дж. Телфорд3, А.М. Сапожников1,2, Е.И. Коваленко1*
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; электронная почта: lenkovalen@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва
3 Национальный институт рака, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд, США
Поступила в редакцию 27.07.14
К настоящему времени показано, что NK-клетки играют важную регуляторную роль в развитии сепсиса, участвуя на его ранних стадиях в усилении провоспалительных реакций и их подавлении на более поздних этапах. Проведено исследование действия бактериального липополисахарида (LPS), важнейшего патогенетического фактора развития сепсиса, на NK-клетки человека ex vivo. Показано, что LPS может активировать наименее зрелые СВ57-негативные NK-клетки, составляющие, как правило, менее половины популяции натуральных киллеров периферической крови человека. В условиях стимуляции IL-2 добавление LPS к таким NK-клеткам индуцирует в них рост продукции IFN-y. При этом действие LPS может приводить как к увеличению, так и к снижению цитотоксической активности NK-клеток. Установлено, что активация NK-клеток при добавлении LPS наблюдается в отсутствие поверхностной формы TLR4 на этих клетках. Результаты исследования подтверждают полученные нами ранее данные о прямом действии липополисахарида на NK-клетки и свидетельствуют о нетипичном механизме активации клеток LPS без участия поверхностного рецептора TLR4.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: NK-клетки, липополисахарид, продукция IFN-y, CD57, цитотоксичность, TLR4.
Натуральные, или естественные киллеры (МК-клетки) — это гетерогенная популяция ци-тотоксических лимфоцитов системы врожденного иммунитета, способных осуществлять быстрый эффекторный ответ по отношению к вирус-инфицированным, опухолевым и иным поврежденным клеткам [1]. Свои мишени МК-клетки распознают с помощью ограниченного набора рецепторов, экспрессия которых не требует перестройки генов. В дополнение к цитотоксической функции МК-клетки регулируют иммунные реакции за счет продукции разнообразных цитокинов и хемокинов, как провоспалительных, так и иммуносупрессирующих. В частности, эти клетки являются важнейшими продуцентами у-интерферона (№N-7) на ранней стадии иммунного ответа [2, 3]. Иммунорегуля-торная активность МК-клеток существенно возрастает под действием цитокинов, секретируе-мых другими иммунными клетками во время воспалительного процесса. В условиях воспале-
* Адресат для корреспонденции.
ния NK-клетки получают также больший доступ в лимфоузлы, где они взаимодействуют с активированными дендритными клетками. Посредством продукции цитокинов и контактных взаимодействий NK-клетки оказывают влияние на многие звенья врожденного иммунитета, корректируя тем самым и последующий антиген-специфический ответ [4].
В последние годы накопилось много данных об участии NK-клеток в патогенезе сепсиса — системной воспалительной реакции, индуцируемой бактериальным липополисахаридом (LPS) [5]. На ранних этапах сепсиса NK-клетки усугубляют развитие системного воспалительного процесса за счет продукции цитокинов, регулирующих активность макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов, что может оказаться решающим фактором, определяющим выживаемость при сепсисе. Так, в мышиных моделях удаление NK-клеток приводило к снижению продукции провоспалительных цитокинов (TNF, GM-CSF, IFN-y) и уменьшению смертности [6]. Наряду с этим активированные NK-клетки спо-
1636
собны оказывать ингибирующее действие на иммунную систему за счет продукции иммуно-супрессирующих цитокинов, таких как IL-10, и элиминации чрезмерно активированных клеток, в частности, макрофагов [7, 8]. Считается, что для успешного излечения больных сепсисом требуется сочетание двух событий: индукции системного воспаления, достаточного для удаления инфицирующих агентов, и развития последующей деактивации иммунной системы для восстановления ее гомеостаза. Важно, чтобы эти процессы протекали адекватным образом, поскольку чрезмерная индукция воспаления может привести к тяжелым повреждениям внутренних органов, а избыточное ингибирование иммунной системы может вызвать длительную иммуносупрессию, при которой организм оказывается незащищенным от проникновения новых инфекционных агентов. В настоящее время известно, что NK-клетки принимают участие в обоих этих процессах. На ранней стадии развития болезни они служат «умножителями воспаления» — взаимно активируют макрофаги и дендритные клетки, главные сенсоры патоген-ассоциированных молекул (т.н. PAMPs). На последующих этапах воспалительной иммунной реакции их функция заключается в элиминировании активированных макрофагов и продукции IL-10 [9]. Изложенные факты свидетельствуют о важности дальнейшего изучения участия NK-клеток в иммунорегуляции, в частности, при развитии системных воспалительных процессов.
До недавнего времени предполагалось, что активирующее действие липополисахарида на NK-клетки происходит исключительно непрямым путем. LPS-индуцированная активация NK-клеток рассматривалась как результат взаимодействия липополисахарида с TLR4 на макрофагах и дендритных клетках, приводящего к продукции цитокинов и формированию контактных взаимодействий, стимулирующих натуральные киллеры [10, 11]. Однако в последние годы появляется все больше данных о том, что LPS, как и другие PAMPs, способен непосредственно активировать NK-клетки. Так, было обнаружено, что NK-клетки экспрессируют разнообразные Toll-подобные рецепторы (TLRs), в том числе TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 (по крайней мере, на уровне мРНК), и в ряде случаев могут быть активированы их различными агонистами [12—15]. Тем не менее в вопросе об участии TLR4 в активации NK-кле-ток LPS остается много непонятного. Некоторые авторы сообщали об экспрессии TLR4 на поверхности NK-клеток человека [16]. Однако, по другим данным, уровень поверхностной
экспрессии TLR4 на NK-клетках человека весьма низок [17—19]. Эти сведения вызывают сомнения в том, что мембранная форма TLR4 опосредует эффекты LPS на NK-клетках. В то же время в NK-клетках был обнаружен пул внутриклеточного белка TLR4, который, в соответствии с опубликованными данными, также может проводить сигнал [20, 21]. Значение этого феномена нуждается в более подробных исследованиях.
Данная работа посвящена изучению не охарактеризованных ранее аспектов реакции NK-клеток на липополисахарид. Главное внимание было уделено анализу воздействия LPS на субпопуляции NK-клеток, различающихся по степени дифференцировки. В задачи работы также входило исследование взаимосвязи между LPS-индуцированной продукцией IFN-y и цитоток-сичностью NK-клеток. Кроме того была исследована динамика поверхностной и внутриклеточной экспрессии NK-клетками TLR4.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и стимуляция NK-клеток. Образцы крови были получены от здоровых добровольцев, давших информированное согласие на использование их крови для данного исследования. Фракцию мононуклеаров получали методом центрифугирования на ступенчатом градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3) («Пан-Эко», Россия). Затем проводили негативную селекцию NK-клеток методом магнитной сепарации с помощью набора для выделения NK-кле-ток человека («Miltenyi Biotec», Германия). Доля клеток CD3CD56+ в полученной популяции составляла не менее 97%. После магнитной сепарации в ряде случаев проводили клеточную сортировку субпопуляций NK-клеток после окрашивания клеток антителами CD3-PC7, CD56-APC («Beckman Coulter», США), CD57-FITC («eBioscience», США). Полученные NK-клетки инкубировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone», США) (200 мкл) в концентрации 1,5 х 106 кл/мл либо 0,5 х 106 кл/мл (для сортированных клеток) в течение 18 ч в присутствии 500 ед/мл рекомби-нантного человеческого IL-2 («Hoffmann-LaRoche», Германия) и 5 мкг/мл LPS E. coli (штамм 055 : В5, «Sigma-Aldrich», США) в 96-луночных круглодонных планшетах («Costar», США). По окончании инкубации собирали супернатанты для анализа содержания цитокинов, а также анализировали экспрессию CD69, TLR4 и цито-токсичность.
Оценка продукции IFN-y. Содержание IFN-y в супернатантах, собранных после инкубации NK-клеток в различных условиях, определяли методом ИФА с помощью набора гамма-интерфе-рон-ИФА-БЕСТ («Вектор-Бест», Россия). Образцы анализировали на планшетном ридере Thermo Multiscan FC («Thermo Fisher Scientific», США) при длине волны 450 нм, референс — 620 нм.
Цитометрический анализ поверхностной экспрессии CD69. После 18 ч инкубации в присутствии IL-2, комбинации IL-2 с LPS или IL-2 с IL-12 (10 нг/мл, «Sigma-Aldrich», США) проводили иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами CD56-APC, CD57-FITC и CD69-PE («^^science», США) с последующим анализом методом многоцветной проточной цитометрии.
Оценка экспрессии TLR4 в NK-клетках. Для оценки поверхностной экспрессии TLR4 NK-клетки окрашивали антителами TLR4-FITC (клон НТА125, «HyCult Biotech», США). Внутриклеточный уровень белка TLR4 определяли с помощью набора Cytofix/Cytoperm Kit («BD Biosciences», США). В качестве контроля использовали изотипические мышиные антитела («Miltenyi Biotec», Германия). Уровень экспрессии TLR4 оценивали методом проточной цито-метрии в выделенном регионе CD56-положи-тельных лимфоцитов. Для идентификации субпопуляции NK-клеток CD57+ в экспериментах с внутриклеточным окрашиванием TLR4 использовали супернатант гибридомы HNK-1 [22].
Цитотоксичность. Цитотоксическую активность оценивали по дегрануляции NK-клеток в присутствии клеток-мишеней как описано ранее [19]; уровень дегрануляции — методом проточной цитометрии с помощью антител CD107a-PC5 («Beckman Coulter», США). В качестве клеток-мишеней использовали линию опухолевых клеток К562.
Проточная цитометрия и клеточная сортировка. Уровень флуоресценции клеток оценивали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.