ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 7, с. 900-904
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 575.1:579.841.11:579.842.11
БАКТЕРИОФАГ phi297 - НОВЫЙ ВИД УМЕРЕННЫХ ФАГОВ Pseudomonas aeruginosa С МОЗАИЧНЫМ ГЕНОМОМ: ВОЗМОЖНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ФАГОТЕРАПИИ
© 2011 г. М. В. Буркальцева1, С. В. Крылов1, А. М. Кропинский2, Е. А. Плетенева1,
О. В. Шабурова1, В. Н. Крылов1
Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва 105064 e-mail: krylov.mech.inst@mail.ru 2University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada N1G 2W1 e-mail: kropinski@uoguelph.ca Поступила в редакцию 25.12.2010 г.
Приведены результаты исследования генома умеренного ореолобразующего бактериофага Pseudomonas aeruginosa phi297 и литической активности его вирулентного мутанта. Определение полной последовательности генома этого бактериофага обнаружило его мозаичную структуру. Часть последовательности генома phi297 гомологична последовательности генома фагов D3 и F116. Особенности морфологии негативных колоний (НК) умеренного бактериофага P. aeruginosa phi297 позволили предположить, что он обладает высокой литической активностью. Был выделен вирулентный мутант фага phi297vir, способный лизировать бактерии, лизогенные по фагу дикого типа. Сравнение литической активности phi297vir с литической активностью фагов из коммерческих смесей двух производителей (предприятий Нижнего Новгорода и Перми) показало, что phi297vir способен лизировать мутанты бактерий РАО1, устойчивые к фагам из коммерческих препаратов, но спектр литической активности phi297vir уже, чем у фагов коммерческих препаратов. Проведенное исследование показало, что применение неревертирующих вирулентных мутантов некоторых умеренных бактериофагов может быть целесообразно в лечении инфекций, вызванных Р. aeruginosa.
В последнее время в связи с возникновением и быстрым распространением множественно устойчивых к антибиотикам штаммов патогенных бактерий, в том числе Pseudomonas aeruginosa, предлагается шире использовать фаготерапию. Однако число известных видов истинно вирулентных (или, как сейчас принято обозначать, "литических") фагов P. aeruginosa ограничено и недостаточно для организации широкомасштабного внедрения фаготерапии. Не исключено, что число фагов, приемлемых для фаготерапии, удастся расширить за счет использования неревертирующих вирулентных мутантов умеренных баткериофагов определенных видов. Умеренные фаги P. aeruginosa представлены большим числом видов, распределенных в две группы по уровню гомологии геномов [1—3]. Первая включает четыре вида фагов-транспозонов, проявляющих разные степени родства между собой [4—6]. Все остальные виды умеренных фагов, не обнаруживая родства с фагами-транспозонами, проявляют следовой уровень ДНК-гомологии в перекрестных попарных сравнениях [1, 3]. В этой группе умеренных фагов особого внимания заслуживают ореолобразующие фаги, продукты которых способны разрушать бактериальные экзополисахариды [7]. Недавно была определена полная последователь-
ность генома одного из фагов этой группы видов — phi297 (вариант ранее описанного фага phi295 [1].)
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериофаги. phi297 (phage_297_GenBank. sqn 297HQ711984), phi297 vir, коммерческие смеси (производители НПО "Микроген", Нижний Новгород (С 2, дата изг. 05.10.2010) и НПО "Микроген", Пермь (С 9-11 дата изг. 02.10.2010)).
Бактерии. Стандартный штамм Pseudomonas aeruginosa PAO1. Клинические изоляты P. aeruginosa : клинические изоляты, выделенные от пациентов с кистозным фиброзом, получены от д-ра К. Пур-сель, Франция (d-r Christine Pourcel, France), клинические изоляты из ожогового центра Челябинской ОКБ получены от д-ра М.А. Поповой, группа клинических изолятов получена от профессора М. Вонехута, Бельгия (prof. Mario Vaneechoutte, Belgium).
Среды. Для выращивания бактерий использовали агаризованную среду LB. Для приготовления суспензий бактериофагов и бактерий использовали стерильный физиологический раствор. В качестве верхнего полужидкого слоя для выращивания бактериофагов на газоне бактерий агаризо-
БАКТЕРИОФАГ phi297 - НОВЫЙ ВИД УМЕРЕННЫХ ФАГОВ
901
1166 1330
4687 432 3208
204 2778 4315
12287 12537
12922 12520
D3
phi297
F116
37683 38473 44003
38315 47637
43055
49134
48415 47579
Рис. 1. Координаты участков генома бактериофага рЫ297, гомологичные участкам геномов фагов D3 и П1б. Схема построена на основании результатов секвенирования [phage_297_GenBank.sqn 297 Н^711984] с использованием программы дот-плот "Гепард".
0
ванная среда ЬВ разводилась 1 : 1 физиологическим раствором [8].
Получение фагов в титре. Фаги получали методом сливного лизиса [9]. Для очистки и концентрации фагов использовали центрифугирование в градиенте плотности CsCl [10].
Работа с препаратами ДНК. Выделение, обработка эндонуклеазами, электрофорез в агарозном геле проводили, как описано в [9].
Анализ полной последовательности ДНК бактериофагов: программа "Гепард" [11].
Выделение компонентов смесей. Коммерческие смеси рассевали на газоны бактерий РАО1 и инкубировали несколько суток, наблюдая за морфологией негативных колоний (НК). НК с разной морфологией выделяли и после повторного пересева получали бактериофаги в высоком титре.
Сравнительные испытания активности компонентов смесей иphi297vir. На чашку Петри с газоном бактерий РАО1 или клинических изолятов наносили капли коммерческих фаговых смесей и тех же смесей с добавлением рЫ297уц\
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты анализа полной последовательности генома бактериофагаphi297
Размер генома бактериофага рЫ297 — 49134 тпн, ГЦ-состав — 62.15%. Обработка результатов секвенирования генома рЫ297 с помощью программы дот-плот "Гепард" и сравнение с геномами других секвенированных фагов в базе данных NCBI обнаружили (см. рис. 1) слабо выраженный мозаичный характер генома бактериофага рЫ297. Кроме подавляющего количества (около 80%) "собственных" генов этот фаг содержит два значительных фрагмента генома, идентичных фрагментам генома конвертирующего фага Э3, с координатами 38473-43055 пн, 44003-47637 пн, и несколько небольших участков, также идентичных последовательности Э3, а также участок, кодирующий интегразу фага БИб [10]. Ни с одним из других секвенированных фагов геном рЫ297 не
проявляет ДНК-гомологии. Учитывая, что общий уровень гомологичных последовательностей существенно ниже 30%, можно считать геном phi297 мозаиком, позволяющим отнести этот фаг к новому виду умеренных фагов.
Характерные особенности НК phi297
После выращивания фага phi297 в течение 12 сут можно наблюдать очень прозрачную зону лизиса с достаточно широким ореолом и рост устойчивых лизогенных бактерий в центре. У остальных видов фагов этой группы нет такой ясной зоны лизиса. Было высказано предположение, что эта зона обусловлена необычно высокой для умеренных фагов литической активностью phi297 и низкой частотой возникновения к нему полностью устойчивых мутантов. Эти признаки могут представлять интерес с точки зрения использования вирулентных мутантов этого фага в терапевтических смесях. Была отобрана группа мутантов этого фага, утративших способность образовывать лизогены, и среди них выявили вирулентный мутант, способный расти на лизогенах по фагу дикого типа. Фаг phi297 и его vir-мутант не растут на лизогенах по фагу D3, который, как известно, обладает конвертирующей активностью [12, 13].
Изучение состава коммерческих препаратов бактериофагов P. aeruginosa
Мы использовали для сравнительного исследования две коммерческие смеси бактериофагов P. aeruginosa, производимые нижегородским и пермским предприятиями. На рис. 2 показаны типы НК, образуемые этими смесями на лабораторном штамме P. aeruginosa PAO1.
Из продукции Нижегородского предприятия на газоне лабораторного штамма были выделены два бактериофага, образующие НК, по морфологии схожие с KMV-подобными фагами P. aeruginosa [14]. Отличия между ними обнаруживаются в размере и морфологии. Два фага, выделенные на тех же бактериях из пермского препарата, разли-
902
БУРКАЛЬЦЕВА и др.
NN1 NN2
В' ЯиИ
Ж ■■ - <я
et "вВИяЗ!
PM1 PM2
Рис. 2. Морфология НК бактериофагов, выделенных на газоне P. aeruginosa РАО1 из коммерческих препаратов.
123456789
чаются между собой в большей степени. Один из них образует НК, схожие по морфологии с KMV-подобными, но отличающиеся от фагов, содержащихся в препарате из Нижнего Новгорода. Его капсиды чувствительны к обработке хлороформом. НК второго фага из пермского препарата сходны с НК phiKZ-подобных фагов. Электрофо-ретическое разделение фрагментов ДНК фагов из коммерческих препаратов после обработки эндо-нуклеазами HindIII и EcoRV (рис. 3) показало, что два фага нижегородского предприятия и один из пермских фагов действительно относятся к одному и тому же виду KMV-подобных фагов и различаются по рестрикционным профилям. Второй фаг из пермского препарата является родственным фагам вида phiKZ.
Сравнение литической активности бактериофага phi279 с литической активностью коммерческих смесей бактериофагов P. aeruginosa
Изучая литические свойства фага phi297, мы сравнили его рост с ростом коммерческих фаговых препаратов на группе разных клинических изолятов. Оказалось, что из 35 клинических изо-лятов коммерческие смеси способны лизировать по 27 образцов, причем спектры литической активности пермского и нижегородского препаратов перекрываются только частично. Литический спектр фага phi297 на группе клинических изоля-тов более ограничен, чем у фагов из коммерческих смесей (phi297 способен лизировать только 10 штаммов, но один из них не поддерживает рост фагов ни одной из терапевтических смесей).
При посеве на газоне P. aeruginosa PAO1 коммерческих смесей фагов из Перми и Нижнего Новгорода было обнаружено, что уже после ноч-
Рис. 3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК бактериофагов из коммерческих препаратов Нижнего Новгорода (ЫМ) и Перми (РМ) после обработки эндонуклеазами HindIII и £coRV. 1 — ДНК X ИтЛП (контроль подвижности фрагментов ДНК); 2-5- ДНК фагов NN1, NN2, РМ1, РМ2 после обработки Нт/Ш1; 6-9 - ДНК фагов NN1, NN2, РМ1, РМ2 после обработки £coRV.
н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.