ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 870-875
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
БЕЛКОВЫЙ СОСТАВ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА ПРИ ИНДУКЦИИ АНТИВИРУСНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ АКТИВАТОРАМИ ЗАЩИТНЫХ
РЕАКЦИЙ И ВТМ-ИНФЕКЦИЕЙ
© 2007 г. Н. А. Рожнова*, Т. И. Одинцова**, Г. А. Геращенков*
*Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа **Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 21.12.2006 г.
У растений сверхчувствительного табака (ЫсоИапа ?аЬасыш L.) сорта Самсун NN изучали способность к образованию некрозов и спектры белков при индукции антивирусной устойчивости, вызванной активаторами защитных реакций (АЗР) растений (арахидоновой кислотой, убихиноном 50 и витамином Е) и вирусом табачной мозаики (ВТМ-инфекцией). АЗР и ВТМ повышали локальную и системную устойчивость листьев к ВТМ. При нативном электрофорезе белков обнаружены различия в составе белков листьев, экстрагируемых при кислых и щелочных условиях. ДДС-ПААГ-электро-форез выявил белки, накапливающиеся при системной устойчивости к вирусу после обработки нижних листьев табака АЗР и при локальной устойчивости, определяемой предобработкой ВТМ. Показано, что спектры белков изменялись под действием различных АЗР сходным образом, в то время как инфекция ВТМ приводила к иным изменениям. На основании экспериментальных данных высказано предположение о возможном функционировании у табака различных путей формирования системной устойчивости, индуцированной АЗР и ВТМ-инфекцией.
Ключевые слова: МсоЫапа 1аЬаспш - арахидоновая кислота - убихинон 50 - витамин Е - антивирусная устойчивость - индуцированные белки - системная индуцированная устойчивость.
ВВЕДЕНИЕ
Растения в ходе эволюции сформировали конститутивные и индуцибельные механизмы устойчивости, направленные на блокирование инфекции потенциальных патогенов, в том числе вирусных [1-3]. Известно, что помимо специфической устойчивости к патогенам, все растения могут проявлять неспецифическую индуцибельную "иммунность" -системную индуцированную устойчивость (СИУ) к последующей инфекции после первичной инокуляции патогенами [3-5] или воздействия химическими или биогенными веществами [6-8]. Синонимами СИУ, используемыми в настоящее время в литературе, являются такие термины как "иммунизация", "сенсибилизация", "приобретенная устойчивость", "вакцинация" или "перекрестная защита" (последний термин понимается как защита от патогена в результате предварительного инфицирования растительных тканей).
Сокращения: АЗР - активаторы защитных реакций, АК -арахидоновая кислота, ВТМ - вирус табачной мозаики, Е -витамин Е, ИФА - иммуноферментный анализ, СИУ - системная индуцированная устойчивость, У - убихинон 50, PR - патоген-зависимые (от pathogenesis-related) белки. Адрес для корреспонденции: Рожнова Наталья Анатольевна. 450054 Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского НЦ РАН. Факс: 8 (3472) 35-61-00, электронная почта: rozhnova@mail.rb.ru
Весьма специфичная индуцированная устойчивость к патогену формируется у растений со сверхчувствительным типом устойчивости [9-11]. Так, некоторые сорта табака, например, Ксанти нк (NN) и Самсун NN, имеют доминантный ген устойчивости или некрозообразования N, происходящий из Nicotiana glutinosa [12]. Суть сверхчувствительного ответа на вирус табачной мозаики (при ВТМ-инфекции) состоит в следующем. В обычных растениях табака, лишенных N-локуса, ВТМ распространяется из первично зараженных клеток по всему растению. Вирус, проникший в ткани сверхчувствительных растений с N-локу-сом, накапливается локально в инфицированных клетках. Затем в месте проникновения патогена формируются некрозы, образующиеся в результате апоптоза инфицированных клеток. После первого (индуцирующего) заражения листья, удаленные от участка начальной инфекции, приобретают повышенный уровень устойчивости к повторному действию ВТМ или иных некротизиру-ющих патогенов: в инокулированных листьях формируется локальная устойчивость, а в неино-кулированных частях сверхчувствительных растений развивается СИУ, приводящая к ослаблению остроты симптомов при повторных инфекциях. У растений табака системная устойчивость обнаруживается в активно растущих верхних ли-
стьях через 2-3 суток и достигает максимума через 7 суток после заражения нижних листьев. Очевидно, СИУ обеспечивает ограничение репродукции патогена и его распространения, что в итоге приводит к снижению числа и размеров некрозов в местах инфекции. Таким образом, инокуляция сверхчувствительных растений вирусами приводит к локализации инфекции в местах первичных поражений и развитию локальной и СИУ к повторному заражению [13, 14].
Различными группами исследователей были обнаружены иммуностимулирующая антивирусная активность препаратов арахидоновой кислоты (АК) [15], убихинона 50 (У) [16], витамина Е (Е) [17] и выявлены оптимальные молярные концентрации этих соединений, вызывающих индукцию локальной и системной устойчивости к вирусным инфекциям у растений сем. Solanaceae. Нами было показано, что среди метаболитов, вовлеченных в формирование антифитовирусной устойчивости, важная роль принадлежит фито-гормонам [18, 19], а также фитогемагглютенинам [20, 21] и иным белкам [22, 23]. Возможно, именно белки выполняют специфические функции в реализации иммунитета растений как на этапах рецепции сигнала [24], его трансдукции (например, при посредстве системиновой системы [25] либо по типу шаперонов, связанных с липидами [3]), так и при последующем формировании и сохранении локальной и системной антивирусной устойчивости у растений. Однако роль белков при формировании антивирусной устойчивости по-прежнему остается слабо понятой. В связи с этим обстоятельством целью настоящей работы был поиск белковых маркеров, ассоциированных с антивирусной устойчивостью у сверхчувствительного табака Самсун NN при действии АЗР (АК, У, Е) и ВТМ-инфекции.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Для исследований использовали 6-8-недельные здоровые растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун NN, выращенные при освещенности 9-10 клк, длине дня 16 ч, температуре 22-23°С днем, 20°С ночью и влажности воздуха 70%. Чистоту материала на вирусную инфекцию проверяли методом иммуно-ферментного анализа (ИФА), с помощью диагностических моновалентных наборов.
Активаторы защитных реакций и ВТМ. В качестве активаторов защитных реакций (АЗР) растений к вирусам были применены следующие соединения: АК ("Fluka", Швейцария), У ("Sigma", США) и Е (фармакопейный препарат 50%-ного витамина Е в масле отечественного производства). Препараты АК, У и Е использовали в концентрации 10-8 М, приводящей к минимальному накоплению фитовирусов.
Для инфицирования листьев табака использовали обыкновенный штамм вируса табачной мозаики (ВТМ). ВТМ относится к группе тобамови-русов, способных индуцировать образование некрозов у сортов табака с геном устойчивости NN. Как известно, капсидный белок ВТМ имеет мол. м. 17.4 кД [26]. Концентрацию вируса определяли на спектрофотометре Сф-26 ("ЛОМО", Россия) по величине оптической плотности раствора, используя коэффициент экстинкции £2б0% = 17. Определение относительного содержания ВТМ в ткани зараженных растений проводили по тесту инфекционности путем сравнительной оценки числа некрозов на половинках листьев табака.
Эксперименты с иммуностимулирующим действием препаратов. Эксперименты с иммуностимулирующим действием АЗР проводили по схеме, описанной нами ранее [16, 18, 19], на растениях с 56 настоящими листьями. Для определения эффективности формирования локальной антивирусной устойчивости в листьях нижнего (первого) яруса и системной антивирусной устойчивости в листьях верхнего яруса (верхний сформировавшийся лист) листья нижнего яруса напыляли карборундом (200 меш) и обрабатывали 0.07 М Na-фосфатным буфером, рН 7.8 (контроль), АЗР в концентрации 10-8 М или ВТМ в концентрации 40 мкг/мл в 0.07 М Na-фосфатном буфере, рН 7.8. Экспериментальные и контрольные группы состояли из 15-20 растений. Через 7 суток нижние и верхние листья сверхчувствительного табака инокулировали ВТМ в концентрации 40 мкг/мл, растирая препарат ВТМ по поверхности листьев стеклянным шпателем, после чего листья промывали водой. Контролем служили растения, обработанные 0.07 М Na-фосфатным буфером, рН 7.8. Растворы используемых препаратов и ВТМ перед нанесением стерилизовали с помощью фильтров FlowPore D ("Sartorius", Германия). Развитие заболевания оценивали по появлению мозаичных симптомов на листьях, учитывали время появления и степень выраженности симптомов. Подсчет некрозов вели на каждом листе инфицированного растения табака на третьи сутки от начала вирусной инокуляции.
Экстракция водорастворимых белков. Через 7 суток после индукции устойчивости были отобраны биологические пробы для исследования спектров водорастворимых белков листьев нижнего и верхнего ярусов. Для экстракции белков использовали две буферные системы: буфер 1 (0.5 М Na-аце-тат, 0.5 М сахароза, 0.3% ß-меркаптоэтанол, рН 4.6) и буфер 2 (50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0.5 М сахароза, рН 8.3).
Навески верхних и нижних листьев растирали в фарфоровой ступке в равном объеме (масса : объем) буферного раствора. Гомогенат переносили в микропробирки ("Eppendorf", Германия) и центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g (Beckman
872
POÊHOBA и др.
200
150
100
ст и
« 50 н
я
о
со п
О 0 р
M
е
н § 50
Ö
е
§100
to «
150
200
250
Верхние листья
3 4 5
У
Нижние листья
Рис. 1. Число некрозов при предобработке нижних листьев сверхчувствительного табака сорта Самсун NN АЗР и ВТМ и последующем инфицировании листьев обоих ярусов ВТМ.
Нижние листья табака обрабатывали 0.07 М фосфатным буфером (рН 7.8) (1), АК (2), У (3) и Е (4) или инфицировали ВТМ (5), через 7 суток проводили заражение нижних и верхних листьев и спустя трое суток оценивали в них число некрозов. Достоверно при р = 0.05 (критическая величина Г = 2.78 при п = 4).
J2-21, CШA) при 4°С. Супернатант разливали дробно в микропробирки и до анализа хранили при -70°С в морозильной камере MDF 381 AT ("Sanyo",
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.