НЕИРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 3, с. 225-232
МЕТОДЫ
УДК 577.352,612.82.14
БЕЛОК СТСР - ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР ГЕНА ПРЕДШЕСТВЕННИКА Р-АМИЛОИДА: ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОРМЫ
© 2004 г. А. А. Востров1, Н. Д. Ещенко2*, М. Дж. Тахени1, В. В. Квичке1
1Факулътет психиатрии Университета Нъю-Иорка, Стоун Брук, США 2Санкт-Петербургский государственный университет, Россия
В статье описана процедура получения и очистки рекомбинантного белка СТСБ (транскрипционного фактора, участвующего в регуляции гена белка-предшественника Р-амилоида), экспрессирован-ного клетками дрожжей РкЫа РаъЮт. Процедура очистки включает последовательное фракционирование на колонках с БР-сефарозой и сефарозой, насыщенной ионами №2+, и аффинную хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой. Полученный белок СТСБ сохранял способность связываться с ДНК и был пригоден для иммунизации животных. Обсуждаются различные приемы выделения, стабилизации белка СТСБ и сохранения его активности в ходе очистки.
Ключевые слова: болезнъ Алъцгеймера, б ело к-предшественник амилоида, транскрипционный фактор СТСР, очистка рекомбинантного белка СТСР.
Характерной невропатологической чертой болезни Альцгеймера является отложение агрегатов пептида Р-амилоида в мозговых тканях больных [1]. Сходная патология наблюдается у больных синдромом Дауна. Пептид Р-амилоида образуется вследствие протеолиза более крупного трансмембранного гликопротеина - предшественника амилоидного белка (АРР). Ген АРР расположен на 21-й хромосоме и экспрессируется в большинстве тканей организма, включая мозг [2-4]. Уровень транскрипта гена АРР повышен в отдельных областях мозга при болезни Альцгеймера, а также при синдроме Дауна [5, 6]. Эти факты указывают на возможность того, что в некоторых случаях повышенная экспрессия гена АРР может принимать участие в развитии патологических процессов, приводящих впоследствии к отложению амилоида.
Ранее нами было установлено что основным активатором экспрессии гена АРР является ядерный фактор CTCF (CCCTC-binding factor), связывающийся с APBP-элементом промотора гена АРР, расположенным примерно за 100 нуклеоти-дов до старта транскрипции [7, 8]. CTCF был первоначально описан как фактор, связывающийся с промотором гена c-myc курицы и вызывающий репрессию этого гена [9]. ДнК-связывающий домен белка CTCF содержит 11 "цинковых пальцев". Используя их различные комбинации, CTCF приобретает способность связываться с широким спектром последовательностей ДНК, которые
* Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9; тел.: (812)328-96-96; e-mail:ne-schenko@mail.ru
часто совершенно не похожи друг на друга. В последнее время было показано, что CTCF является полифункциональным белком, участвующим не только в активации или репрессии транскрипции, но и в инсуляции - процессе разграничения хроматина на функциональные домены, а также и в регуляции импринтинга генов (см. обзор [10] ).
Очистка белка CTCF сопряжена со значительными трудностями, во многом связанными с инактивацией белка при изменении солевых условий [7], поэтому многие авторы при работе с CTCF in vitro вынуждены ограничиваться применением препаратов белка, полученных путем транскрипции-трансляции в бесклеточной системе, что налагает определенные ограничения на возможности эксперимента. Ранее нами была кратко описана методика получения и очистки рекомбинантного CTCF, экспрессированного в дрожжах Pichia Pastoris. Полученные препараты CTCF сохраняли способность к связыванию с ДНК, а также к активации транскрипции гена АРР in vitro [8].
Другим фактором, осложняющим изучение CTCF и его роли в клетке, является узкий спектр доступных антител к белку. На момент написания этой статьи все коммерческие препараты антител к CTCF были получены путем иммунизации животных пептидами, содержащимися в последовательности CTCF. Большинство таких антител не взаимодействует с нативным белком, и поэтому область их применения ограничена иммуно-блоттингом. Проблема получения антител к на-тивному белку упирается в упомянутые трудности с его очисткой.
В данной статье детально описывается процедура получения высокоочищенного препарата рекомбинантного CTCF, экспрессированного в дрожжах Pichia Pastoris, пригодного к использованию его для иммунизации мышей и попытки получения панели моноклональных антител к белку.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование рекомбинантных дрожжей Pichia Pastoris. В клонированную кДНК CTCF человека была внесена путем сайт-специфического мутагенеза вставка, кодирующая четыре дополнительных гистидиновых аминокислотных остатка, расположенных непосредственно за инициирующим метионином. Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia Pastoris, экспрессирующих этот белок, получали при помощи набора компании Invitrogen (США), согласно инструкции производителя. Для клонирования в Pichia Pastoris использовали плазмиду pPIC3.5 (Invitrogen, США). Затравочную культуру дрожжей выращивали в 50 мл среды BMG (100 мМ K3PO4 pH 6.0; 1.35% YNB (Yeast Nitrogen Base with ammonium sulphate, Difco); 4 x 10-5% биотин; 1% глицерин) на качалке в течение ночи при 30°С до насыщения. Далее затравочную культуру подращивали в объеме 0.5 л на качалке, затем в объеме 2 л в ферментере (New Brunsweek Scientific Co., США) в среде BMG при аэрации стерильным воздухом с расходом 2 л/мин при постоянном значении рН 6.0 и скорости перемешивания 600 об/мин в течение ночи при 30°С. В этих условиях к концу ферментации наблюдалась полная утилизация глицерина, что подтверждалось восстановлением концентрации растворенного кислорода в среде. Затравочную культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин, из осадка после взвешивания отбирали 80 г дрожжей, которые ресуспендирова-ли в среде BMM (100 мМ K3PO4 pH 6.0; 2.7% YNB; 4 x 10-5% биотин; 0.5% метанол). Объем культуры доводили средой BMM до 5 л и выращивали дрожжи в описанных выше условиях в течение 95-100 ч при непрерывной подпитке метанолом со скоростью расхода его, равной 30 мл/сут. Через 50 ч после начала индукции метанолом к культуре добавляли дополнительно 500 мл 13% раствора YNB.
Анализ рекомбинантного CTCF. Связывание CTCF с ДНК анализировали методом сдвига элект-рофоретической мобильности. Реакцию связывания проводили в объеме 16 мкл в буфере, содержащем 40 мМ HEPES, pH 7.6, 2 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 75 мМ KCl, 10% глицерин, 2.5% CHAPS. Реакцию проводили в присутствии 1 мкг двухцепо-чечного полимера ДНК poly(dl-dC) ■ poly(dl-dC) (Pharmacia Biotech) в качестве ингибитора белков, неспецифически связывающихся с ДНК. При до-
бавлении к реакционной смеси фракций CTCF необходимо учитывать, что они обычно находятся в буфере, содержащем повышенную концентрацию KCl, которая должна быть снижена добавлением к смеси бессолевого буфера для достижения оптимальной конечной ионной силы раствора. После преинкубации CTCF в реакционной смеси в течение 1-3 мин при комнатной температуре к смеси добавляли 2.5 нг 32Р-олигонуклеотида APBß-80WT длиной 80 нп, описанного ранее [8], радиоактивно меченного полинуклеотидкиназой по 5'-концу; специфическая активность препарата составляла 20-50 тысяч имп/мин на 1 нг. Реакцию связывания проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Для количественного определения ДНК-связывающей активности фракции CTCF предварительно титровали в буфере, содержащем 1 М мочевину, а в реакции использовали 22 нг (0.5 пмоль) меченого олигонук-леотида. Присутствие мочевины во фракциях на качество анализа не влияло. По окончании реакции связывания к смеси добавляли 1.5 мкл фе-тальной бычьей сыворотки и продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 5% полиакрил амидном геле в 0.5-кратном трис-бо-ратном буфере [11]. Гель фиксировали 30 мин в 10%-ной уксусной кислоте и 20%-ном метаноле и высушивали. Количество радиоактивности в зонах определяли при помощи прибора Phosphor Imager (Bio-Rad, США). За единицу сдвига элект-рофоретической мобильности (есм) принимали количество фактора, необходимого для сдвига 1 нг олигонуклеотида в зону с уменьшенной элек-трофоретической мобильностью.
Денатурирующий электрофорез белков проводили в 6%-ном полиакриламидном геле в трис-глициновой системе в присутствии ДСН [12]. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым синим. Количество белка в зонах определяли путем титрования и сравнения интенсивности окраски зон с альбуминовым стандартом.
Общий белок во фракциях определяли колориметрически с использованием реактива BioRad Protein Assay (Bio-Rad, США), стандартом служил альбумин.
Очистка рекомбинантного CTCF. По окончании индукции метанолом клетки собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин, промывали буфером, центрифугировали повторно и замораживали при - 80°С для хранения.
Размороженные клетки гомогенизировали в приборе Bead Beater (Biospec Products Inc., США) с использованием стеклянных шариков диаметром 0.5 мм в буфере для лизиса, содержащем 40 мМ HEPES, pH 7.6, 2 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 100 мкМ ZnSO4, 5% глицерин 100 мМ KCl, 5 мМ DTT и 1 М мочевину. Гомогенизацию проводили на льду де-
вятью 30-секундными импульсами с перерывами по 2 мин для охлаждения, причем каждый третий перерыв дополнительно удлиняли до 10 мин. Экстракт осветляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин и ультрацентрифугированием при 35000 об/мин в течение 90 мин. При ультрацентрифугировании формировались неплотные осадки, поэтому при отборе супернатан-та практически невозможно было полностью избавиться от примесей взвешенного осадка. Для удаления взвеси экстракт фильтровали сначала через фильтровальную бумагу Whattman 3ММ, а затем - через 0.8 мкм полисульфоновый фильтр.
Первый этап очистки CTCF проводили на колонке с SP-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенной буфером для лизиса, который содержал 200 мМ KCl. К отфильтрованному дрожжевому экстракту добавляли 3М KCl до конечной концентрации 0.2 М. Экстракт наносили на колонку с SP-сефарозой перистальтическим насосом (Hi-TrapSP-HP, Pharmacia Biotech) при скорости тока 4 мл/мин. Колонку промывали 10 мл буфера A (40 мМ HEPES, pH 7.6, 2 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 10 мкМ ZnSO4, 20
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.