научная статья по теме БЕЛОК ICP27 ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ТИПА 1 ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ ПУТЕМ ПОВЫШЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА Биология

Текст научной статьи на тему «БЕЛОК ICP27 ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ТИПА 1 ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ ПУТЕМ ПОВЫШЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 3, с. 470-477

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 578.2; 578.82/84; 576.52; 577.352

БЕЛОК ICP27 ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ТИПА 1 ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ ПУТЕМ ПОВЫШЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

© 2008 г. Jin Chul Kim, Seo Hyun Choi, Jeong Ki Kim, Sang Yong Kim, Hye Jin Kim, Jin Su Im, Soo Yun Lee, Jong Min Choi, Hee Min Lee, Jeong Keun Ahn*

Department of Microbiology, School of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University,

Daejeon, 305-764, Korea Поступила в редакцию 13.06.2007 г.

Принята к печати 16.06.2007 г.

Сверхранний белок ICP27 вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) принимает участие в процессах вирусной репликации, активации транскрипции, стабилизации РНК, в апоптозе и реактивации латентного вируса. Последняя тесно связана с апоптозом и окислительным стрессом. Для изучения действия белка ICP27 на апоптоз исследовали гибель синтезирующих ICP27 клеток (3-3) в присутствии перекиси водорода. При окислительном стрессе клетки 3-3 были подвержены разрушению (чувствительны к индукции гибели) и демонстрировали такие типичные признаки апоптоза, как олигонуклеосомная фрагментация ДНК, конденсация хроматина и накопление клеток стадии Go/Gj. Для того, чтобы понять, каким образом белок ICP27 повышает склонность (чувствительность) клеток к индукции апоптоза, в клетках 3-3 определяли внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК), который оказался выше, чем в клетках Vero, не содержащих ICP27. Повышенный внутриклеточный уровень АФК в клетках 3-3 вызван повреждением системы антиокси-дантных ферментов. Это приводит к увеличению активности фактора AP-1, что сопровождается повышением синтеза белка Bax и снижением синтеза белка Bcl-2. Кроме того, клетки 3-3 весьма чувствительны к различным индукторам апоптоза. Эти результаты позволяют заключить, что белок ICP27 HSV-1 увеличивает чувствительность клеток к стимуляции апоптоза путем увеличения внутриклеточного уровня АФК.

Ключевые слова: HSV-1, белок ICP27, апоптоз, АФК.

HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1 ICP27 INDUCES APOPTOTIC CELL DEATH BY INCREASING INTRACELLULAR REACTIVE OXYGEN SPECIES, by Jin Chul Kim, Seo Hyun Choi, Jeong Ki Kim, Sang Yong Kim, Hye Jin Kim, Jin Su Im, Soo Yun Lee, Jong Min Choi, Hee Min Lee, Jeong Keun Ahn* (Department of Microbiology, School of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University, Daejeon, 305-764, Korea; *e-mail: jkahn@cnu.ac.kr). HSV-1 ICP27, an immediate early protein of herpes simplex virus type 1, is involved in viral replication, transcriptional activation, RNA stability, apoptosis, and reactivation from viral latency. The reactivation from viral latency is closely related to apoptosis and oxidative stress. To understand the effect of ICP27 upon apoptosis, we tested for cell death of ICP27-expressing cells (3-3) in the presence of hydrogen peroxide. Under oxidative stress, 3-3 cells were sensitive to death, displaying typical apoptosis features such as oligonucleosomal DNA fragmentation, chromatin condensation, and G0/G1accumulation. To dissect the sensitizing mechanism of ICP27 in apoptosis, we analyzed the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) in 3-3 cells. We found that 3-3 cells exhibited increased ROS levels compared to Vero cells devoid of ICP27. We also observed that the increased levels of intracellular ROS in 3-3 cells were caused by disturbances in antioxidant enzymes. In 3-3 cells, the elevated ROS increased the AP-1 activity, subsequently the expression of Bax increased, and the expression of Bcl2 was reduced. In addition, 3-3 cells were sensitive to various apoptotic agents. Taken together, these results indicate that HSV-1 ICP27 sensitizes the cells to apoptosis by elevating the intracellular levels of ROS.

Key words: HSV-1, ICP27, apoptosis, ROS.

Вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) - широ- ка разнообразные заболевания, в том числе "лихо-

ко распространенный патоген - вызывает у челове- радку" на губах при простуде, кератит, конъюнк-

__тивит, слепоту, энцефалит, рецидивирующую

* Эл. почта jkahn@cnu.ac.kr генитальную инфекцию и неонатальные инфек-

ции. Действуя как нейротропный вирус, HSV-1 может находиться в латентном состоянии в ганглиях тройничного нерва и вызывать их поражение при реактивации. При развитии инфекции в культуре клеток наблюдается строго регулируемый каскад экспрессии генов HSV-1. Гены вируса разделяют на три основных кинетических класса: сверхранние (immediate early, IE), ранние (early, E) и поздние (late, L). Гены класса IE транскрибируются самыми первыми в отсутствие синтеза вирусных белков de novo. Сразу же после инфекции гены IE транс-акти-вируются вирусным белком оболочки VP16. Продукты генов IE - белки ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27 -кооперативно регулируют экспрессию всех классов вирусных генов. Следующими по времени экспрес-сируются гены Е, которые кодируют белки, участвующие в синтезе вирусной ДНК. L-гены кодируют, в основном, структурные компоненты вируса, такие как белок VP16 и различные гликопротеины [33].

Белок ICP27, кодируемый одним из IE-генов, представляет собой ядерный фосфопротеин с мол. массой 63 кДа и состоит из 512 аминокислотных остатков. Этот белок необходим для репликации вируса и, кроме того, требуется для переключения экспрессии ранних на поздние гены вируса [1]. Белок ICP27 повышает уровень репликации вирусной ДНК путем транс-активации группы ранних генов, вовлеченных в репликацию ДНК. Транскрипция поздних генов тоже стимулируется белком ICP27 [2]. Кроме того, белок ICP27 выполняет множество других функций на посттранскрипционном уровне с тем, чтобы выключить экспрессию генов клетки-хозяина [3]; он связывается также с вирусными транскриптами [4] и стимулирует 3'-процессинг пре-мРНК [5]. Показано, что белок ICP27 вовлечен в реактивацию вируса при латентной инфекции [6].

Латентная инфекция - уникальное биологическое явление, характерное для семейства вирусов герпеса. HSV-1 инфицирует клетки слизистой оболочки и распространяется по чувствительным нервам до ганглиев тройничного нерва [7, 8]. В латентный период геном HSV-1 "переживает" в виде кольцевой ДНК. Этот латентный вирус может реактивироваться под воздействием различных стимулов, например, при повреждении тканей, иннервируемых соответствующими нейронами, или при окислительном стрессе [9], который тесно связан с апоптозом [10, 11]. Для сохранения латентного состояния вируса апоптоз инфицированных клеток должен быть подавлен. Есть данные, что транскрипт HSV-1, ассоциированный с латентным состоянием вируса (latency-associated transcript, LAT), защищает нейроны ганглиев тройничного нерва от апоптоза [11], а белок ICP27 HSV-1 может быть вовлечен в реактивацию латентного вируса [6]. У другого герпесвиру-са - вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicelle Zoster virus) - продукт гена ORF4,

гомологичный белку ICP27 HSV-1, тоже необходим для формирования латентной инфекции [12]. Поэтому исследование роли белка ICP27 HSV-1 в апоптозе, вызванном окислительным стрессом, может привести к пониманию механизмов латентной инфекции и реактивации вирусов. Для выяснения действия белка ICP27 на апоптоз, индуцированный окислительным стрессом, мы изучали, происходит ли гибель клеток линии 3-3, экспрессирующих белок ICP27, в присутствии перекиси водорода. Эти клетки оказались наиболее чувствительны к факторам, индуцирующим гибель клетки, и проявляли такие типичные признаки апоптоза, как олигонуклеосомная фрагментация ДНК, конденсация хроматина и накопление клеток стадии G0/G1. Кроме того, в клетках 3-3 наблюдали повышенный уровень внутриклеточных активных форм кислорода (АФК). Обработка антиоксидантом N-ацетил-Ь-цистеином (NAC) снижает степень гибели клеток 3-3 до нормального уровня. Это позволило предположить, что апоптоз клеток 3-3 определяется повышенным содержанием в них АФК. При этом уровень антиокислительных ферментов в клетках 3-3 оказался пониженным; другими словами, содержание внутриклеточных АФК повышается в результате нарушения равновесия между окислением и восстановлением. В клетках 3-3 наблюдали повышение активности фактора АР-1, которая тоже снижается при обработке клеток ацетилцистеином. Можно думать, что именно АФК приводят к повышению активности фактора АР-1. В результате этого в клетках повышается уровень синтеза белка Bax и снижается уровень синтеза белка Bcl-2. Кроме того, клетки 3-3 оказались чувствительны к различным индукторам апоптоза, например, к УФ-облучению и обработке TNF-a и этопозидом. Наши результаты позволили предположить, что белок ICP27 HSV-1 повышает чувствительность клеток к факторам индукции апоптоза, увеличивая в них уровень АФК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки, реагенты и вирусы. Клетки почки африканской зеленой мартышки (линия Vero) поддерживали в среде DMEM ("HyClone"), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка ("Gibco") и 1% смеси антибиотиков и антигрибковых агентов ("Gibco"). Клетки 3-3 (клетки Vero, синтезирующие белок ICP27 HSV-1) любезно предоставлены д-ром Шаффером (P. Shaffer, Harvard University, США). Перекись водорода (Н2О2), иодид пропидия, краситель Hoechst 33342, МТТ (бромид 3 - [4,5 -диметилтиазол-2-ил] -2,5 -дифенил-тетразолия), родомин-123, TNF-a и этопозид получены от компании "Sigma". Дихлорофлуоресцеи-нацетат (DCFH-DA) получен от фирмы "Fluka". Штамм KOS HSV-1 выращивали и титровали на клетках Vero. Монослой клеток инфицировали би-

русом при множественности инфекции (MOI), равной G.1, 1 или 1G, согласно протоколу [9].

Вестерн-блот анализ. Клетки Vero, 3-3, а также клетки Vero, инфицированные HSV-1, лизировали непосредственно в содержащем SDS буфере для образцов, разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на мембрану PVDF ("Millipore") и анализировали с помощью иммуноблотинга с антителами против белка ICP27 ("Santa Cruz") и ß-актина ("Sigma").

Aнализ жизнеспособности клеток. Степень гибели клеток определяли по тесту с MTT. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах (1 x 1G4 клеток на лунку) и инкубировали в присутствии H202 в различных концентрациях. В каждую лунк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком