УДК 577.24
белок pml образует комплекс с геликазой wrn и регулирует репарацию двуцепочечных разрывов
в днк, индуцированных у-излучением*
© 2011 г. Цзилай Лю, И Сун**, Цзюнцзе Цянь, Бинь Лю, Янь Дун, Баолэй Тянь, Чжисянь Сунь**
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Taiping Road 27, Beijing 100850, China;fax: 86(10)6817-7417, E-mail: songyibj@sina.com.cn; sunzx@nic.bmi.ac.cn
Поступила в редакцию 18.10.10
Установлено, что после иррадиации клеток у-лучами геликаза транслоцируется из ядрышка в кариоплазму и принимает участие в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК. Перемещение геликазы после облучения клеток нарушается при дефиците эндогенного белка PML, вызванном нокдауном, и стимулируется при повышенной экспрессии рекомбинантного белка PML IV. После иррадиации белок PML IV формирует комплекс с геликазой. Участок молекулы белка PML, расположенный между аминокислотными остатками с 394-го по 433-й, важен для образования такого комплекса. Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью домена (394—433) белок PVL осуществляет регуляцию процесса транслокации геликазы, способствует репарации ДНК, а также опосредует чувствительность клеток к иррадиации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: PML, WRN, у-излучение, повреждение ДНК, репарация ДНК.
Предполагается, что геликаза синдрома Вер-нера (WRN) по аналогии с ДНК-геликазой ЯееР участвует в различных процессах метаболизма ДНК и находится в дефиците в клетке при аутосомном рецессивном заболевании — синдроме Вернера ^8). Одним из основных признаков WS является нестабильность клеточного генома, что свидетельствует об участии геликазы в поддержании целостности ядерной ДНК [1]. Ранее было отмечено, что в клетках млекопитающих, несущих поврежденную ДНК, WRN перемещается из ядрышка в нуклеоплазму и вовлекается в репарацию генома [2—4].
Ядерные тельца лейкемических промиело-цитов (РМЬ N6) являются динамичными мак-
ромолекулярными структурами, реагирующими на различные повреждения ДНК путем изменения своего количества, размера и содержания. Изменение этих структур происходит при протекании таких фундаментальных защитных клеточных процессов, как репарация ДНК, транскрипция и апоптоз. Например, было показано, что в ответ на повреждение ДНК многие факторы репарации транслоцируются внутрь PML NB или из них [5]. Хотя и имеются сообщения о том, что эктопически экспрессированная WRN может формировать фокусы в нуклеоплазме, а также локализоваться вместе с PML NB [6, 7], точных данных о функциональной взаимосвязи между эндогенными протеинами PML и WRN в настоящее время не имеется.
Продемонстрировано, что после радиоактивного облучения клеток геликаза перемещается из ядрышка в кариоплазму и окрашивается в локусах фосфогистона Н2АХ (y-H2AX) и фос-форилированного белка ATM (ATMser1981-P). Этот процесс — решающий для репарации двуцепо-чечного разрыва в ДНК (DSB). Эндогенный белок PML образует комплекс с геликазой, причем один из структурных доменов молекулы этого белка, заключенный между аминокислотными остатками с 394-го по 433-й, принимает участие во взаимодействии с геликазой и вовле-
Принятые сокращения: DSB — двуцепочечные разрывы в ДНК, WS — синдром Вернера, WRN — геликаза синдрома Вернера, PML NB — ядерные тельца лейкемических промиелоцитов, PML — белок лейкемических про-миелоцитов, ATM — мутантный протеин синдрома Луи—Бар (атаксия—телеангиестазия), y-H2AX — фосфо-гистон Н2АХ, GFP — зеленый флуоресцирующий белок, DAPI — 4',6-диамидино-2-фенилиндол, HEL — эмбриональные фибробласты легких человека.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 10-310, 13.02.2011.
** Адресат для корреспонденции.
5
673
чен в репарацию. Таким образом, можно предположить, что, действуя кооперативно с гелика-зой, белок РМЬ играет важную роль в передаче сигнала от и способствует процессу репарации ДНК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Конструирование плазмид. Векторы экспрессии рЕОБР-РМЬ и рСМУ-шуе-РМЬ, несущие последовательность, соответствующую РМЬ IV человека, были описаны ранее [8]. Плазмидные векторы, несущие укороченные РМЬ IV или РМЬ IV с делецией, были получены методом ПЦР с использованием перечисленных ниже праймеров (нуклеотидные последовательности мест расщепления эндогенными энзимами, не отмечены, АА — аминокислотные остатки):
РМЬ IV (1—633АА): 5'-АТООАОССТОСАС-ССОСССОАТСТССОАО-3',
РМЬ IV Б2 (361—633АА): 5'-САООАООАОСС-ССАОАОССТ-3',
РМЬ IV Б3 (394—633АА): 5'-ОАТОСАОСТОТА-ТССААОАА-3',
РМЬ IV Б4 (433—633АА): 5'-ОСТОААОСССАО-ССТАТООСТ-3',
РМЬ IV Б4 (делеция 433-633АА): 5'-АОСТСТТ-ОСАТСАСССАОООООСТОААОСССАОСС-ТАТООСТ-3',
РМЬ IV Ш (1—360АА): 5'-ТТАОСОСАООСОО-САОАОСОССТ-3',
РМЬ IV Я2 (делеция 433-633АА): 5'-АОССАТА-ООСТОООСТТСАОСССССТОООТОАТО-СААОАОСТ-3',
РМЬ IV Я3 (1—633АА): 5'-СТАААТТАОАААОО-ООТОООООТА-3'.
Клеточные культуры и трансфекция генов. Были использованы следующие клетки: первичная культура эмбриональных фибробластов легких человека (НЕЬ), любезно предоставленная Сяо-фэй Чжэн; культура клеток карциномы молочной железы линии МСБ-7 и клетки эпителиальной аденокарциномы легких линии А549.
Клетки культивировали в среде Дульбекко (БМЕМ) («О&ео», США), содержавшей 10%-ную фетальную сыворотку крупного рогатого скота. Плазмиды в клетки вводили с помощью реаген-
та для трансфекции FuGENE® HD («Roche Diagnostics», Германия).
Целевые последовательности интерферирующих PML (5'-GAGUCGGCCGACUUCUG-GU-3') и для WRN siPHK (5'-GUUCUUGU-CACGUCCUCUG-3') были выбраны на основании результатов предыдущих исследований [9, 10]. Эти двуцепочечные олигонуклеотиды были синтезированы фирмой «GenePharma Company» (Китай) и затем введены в пролиферирующие клетки с помощью реагента для трансфекции INTERFERin™ («Polyplustransfection™», Франция).
Иммунопреципитация. Клетки (1 • 107) лизи-ровали в буфере M-PER («Invitrogen», США), содержавшем коктейль из ингибиторов протеаз («Roche», Германия). Меченые антитела (анти-Myc и анти-GFP), используемые для преципитации, были получены от фирмы MBL (Япония). Для проведения каждого эксперимента по преципитации использовали 500 мкг клеточного белка и 5 мкг антител. Осветленные клеточные лизаты инкубировали с антителами при осторожном перемешивании в течение 1 ч при 4°. Затем добавляли по 20 мкл суспензии протеин-A/G-агарозы («Santa Cruz», США) и инкубировали в течение ночи при 4°. Агарозные гранулы собирали центрифугированием и 5 раз активно промывали буфером для лизиса. Иммунный комплекс элюировали путем кипячения агароз-ной суспензии в двукратном буфере для Ds-Na-ПААГ-электрофореза.
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки выращивали на покровных стеклах в 12-луноч-ных планшетах. Через определенные промежутки времени после облучения (в дозе 10 Гр с использованием источника радиации на основе 60Co со скоростью 3,66 Гр/мин) клетки промывали 3 раза буфером PBS, фиксировали 4%-ным параформальдегидом при 4° в течение 20 мин, а затем инкубировали в присутствии 0,2%-ного Triton Х-100 в течение 10 мин. Неспецифическую сорбцию блокировали с помощью 1%-ного БСА в буфере PBS в течение 60 мин. Стекла обрабатывали первичными антителами WRN H300, PML H238, C23 («Santa Cruz»), pATM и y-H2AX («CellSignaling», США) в течение 15 ч при 4°, отмывали 3 раза буфером PBS, а затем инкубировали со вторичными антителами, меченными флуоресцентными красителями Alexa 555 или Alexa 488, в течение 1 ч при комнатной температуре. Изображения флуоресцирующих клеток получали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа 510 («Carl Zeiss», Германия) или микроскопа IX-70 («Olympus», Япония), учитывая такие параметры, как яркость, контраст и т.д. Каждый эксперимент повторяли от 3 до 6 раз.
Вестерн-блоттинг. Клетки лизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), содержавшем коктейль из ингибиторов протеаз («Roche»). Через 1 ч инкубации при осторожном перемешивании при 4° образцы осветляли центрифугированием при 12 000 g в течение 20 мин при 4° и определяли концентрацию белка с использованием БСА и набора фирмы «Pierce» (Франция). По 40 мкг белка наносили на 10%-ный ПААГ, и проводили электрофорез в присутствии Ds-Na. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны Hybond-ECL («GE Healthcare», США) и визуализовали путем инкубации сначала с различными первичными антителами WRN H300 и PML E15 («Santa Cruz»), а затем с вторичными антителами, конъ-югированными с пероксидазой («Invitrogen»).
Изучение апоптоза. Клетки промывали буфером PBS. Меченный с помощью флуоресцеин-изотиоцианата аннексин V (FITC-Annexin V) разбавляли до концентрации 1 мг/мл буфером для связывания. Клетки ресуспендировали в 1 мл раствора аннексина и инкубировали 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем к клеточной суспензии добавляли йодид пропи-дия в конечной концентрации 1 мг/мл, после чего смесь анализировали методом проточной цитофлуорометрии. Для морфологического анализа апоптоза клетки фиксировали 4%-ным па-раформальдегидом, окрашивали с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в концентрации 1 мкг/мл в течение 5 мин и рассматривали под флуоресцентным микроскопом («Olympus»).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
После облучения клеток эндогенная WRN перемещается в нуклеоплазму и участвует в репарации DSB. В первую очередь мы исследовали методом иммунофлуоресценции и Вестерн-блот-тинга динамику экспрессии и локализацию ге-ликазы в клетках HEL, содержавших вызванные у-излучением повреждения ДНК. Согласно полученным ранее [2, 4] и нашим данным (рис. 1, а (см. цветную вклейку) и рис. S1C (см. Приложение (Suplimentary information) на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 10-310, 13.02.2011)); геликаза локализована главным образом в ядрышке и транслоцируется в нуклеоплазму после облучения клеток. Для полуколичественной оценки транслокации WRN мы подсчитывали клетки HEL, содержавшие нуклео-плазматическую геликазу, до и после облучения. Как видно на рис. 1, б, лишь у ~10% необлучен-ных клеток геликаза находилась в нуклеоплаз-
ме. Облучение приводило к увеличению числа клеток, содерж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.