^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
БИКАРБОНАТ ЗАЩИЩАЕТ ВОДООКИСЛЯЮЩИЙ КОМПЛЕКС ФОТОСИСТЕМЫ II ОТ ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ В ИНТАКТНЫХ КЛЕТКАХ Chlamydomonas reinhardtii
© 2007 г. С. К. Жармухамедов, Г. Н. Ширшикова, 3. В. Маевская, Т. М. Антропова, В. В. Климов
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук,
Московская обл., Пущино Поступила в редакцию 07.09.2006 г.
Имеющиеся в настоящее время данные о действии бикарбоната на Mn-содержащий водоокисляю-щий комплекс (ВОК) ФС II получены почти исключительно in vitro - на субхлоропластных мембранных фрагментах, обогащенных ФС II. Для исследования эффекта бикарбоната на донорную сторону ФС II растений in vivo мы использовали метод темновой термоинактивации целых клеток Chlamydomonas reinhardtii. Фотосинтетическую активность ФС II измеряли с помощью фотоиндуци-рованных изменений выхода флуоресценции хлорофилла ФС II и по скорости фотосинтетического выделения кислорода. Для устранения "прямого" эффекта отсутствия бикарбоната на активность ФС II перед измерением фотосинтетической активности концентрацию бикарбоната выравнивали посредством добавления к каждому из образцов (кроме тех, которые уже содержали NaHCO3 при термоинактивации) NaHCO3 до получения конечной концентрации 5 мМ. Это позволяло регистрировать только так называемый "необратимый", т.е. не обращаемый последующим добавлением бикарбоната эффект отсутствия бикарбоната в процессе термоинактивации. Показано, что если в среду перед проведением термоинактивации добавляли 5 мМ бикарбоната, скорость термоинактивации донорной стороны ФС II в среде, истощенной по бикарбонату, уменьшалась в 1.5-2.0 раза. Полученные результаты интерпретируются как указание на то, что бикарбонат защищает донорную сторону ФС II от термоинактивации и in vivo, в целых клетках C. reinhardtii. Это, в свою очередь, доказывает справедливость высказанного ранее предположения о том, что бикарбонат является интегральным компонентом Mn-содержащего ВОК ФС II.
Chlamydomonas reinhardtii - ФС II - водоокисляющий комплекс - бикарбонат - термоинактивация - фотосинтез
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 342-349
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Прямые доказательства, свидетельствующие о стимулирующем действии бикарбоната на скорость реакции Хилла, впервые были представлены Warburg и Krippahl [1]. Эти авторы считали, что эффект бикарбоната может быть связан с функционированием донорной стороны ФС II. О
возможном влиянии ионов HCO- на систему фотосинтетического окисления воды и выделения кислорода писали и в ряде других научных публикаций [2-4]. Однако, большая часть полученных впоследствии экспериментальных данных интер-
Сокращения: ВОК - водоокисляющий комплекс, РЦ - реакционный центр, ДФ - изменение выхода флуоресценции хлорофилла.
Адрес для корреспонденции: Жармухамедов Сергей Кушта-евич. 142290 Московская обл., Пущино, Институтская ул., 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: lwomain@issp.serpukhov.su
претировалась как указание на то, что участок действия НСО3 локализован на акцепторной стороне ФС II [5-9]. На акцепторной стороне ФС II бикарбонат влияет на перенос электрона между первичным и вторичным хиноновыми акцепторами электрона, соответственно, QA и QB. Было показано, что негемовое железо, расположенное между QA и QB, является местом связывания бикарбоната [7].
В недавних работах [10-17] было установлено, что бикарбонат строго необходим и для оптимального функционирования донорной стороны ФС II. На кислород-выделяющих фрагментах ти-лакоидных мембран, обогащенных ФС II, было показано, что для подавления функционирования донорной стороны ФС II, обращаемого последующим добавлением бикарбоната, требуются гораздо более низкие (в 1000 раз) концентрации формиата, чем для подавления переноса электронов на акцепторной стороне. Стимулирующий
эффект бикарбоната особенно выражен на так называемых "безмарганцевых" препаратах ФС II, когда эффективное восстановление транспорта электронов к реакционному центру (РЦ) с помощью экзогенного Mn2+ (0.1-0.2 мМ) возможно только в присутствии бикарбоната. Были представлены убедительные доказательства в пользу того, что бикарбонат принимает участие в формировании Mn-центра, способного к окислению воды [18].
Кроме того, было показано, что чувствительность водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС II к действию повышенных температур (термоинактивации) и света высокой интенсивности (фотоинактивации) значительно возрастает при удалении HCO3 /СО2 из среды и уменьшается при последующем добавлении 1-5 мМ бикарбоната. Был сделан вывод о том, что бикарбонат - строго необходимый компонент Mn-содержащего ВОК ФС II [15].
Практически все эти данные о действии бикарбоната на донорной стороне ФС II были получены на изолированных субтилакоидных препаратах, обогащенных ФС II. Исследование эффектов бикарбоната in vivo сопряжено с определенными трудностями, обусловленными, в частности, поглощением CO2 в цикле Кальвина и выделением CO2 в качестве метаболита при темновом дыхании и фотодыхании живой клетки. В целом, имеющиеся немногочисленные публикации о действии бикарбоната in vivo - противоречивы и неоднозначны. Govindjee и Eaton-Rye [19] представили данные о стимулирующем эффекте бикарбоната на перенос электрона от QA к QB в клетках зеленой водоросли Scenedesmus. На основе результатов, полученных в экспериментах с клетками водоросли Chlamydomonas stellata, Mende и Wiessner [20] сделали вывод о том, что истощение по HCO3 /СО2 оказывает существенное влияние как непосредственно на процесс фотосинтетического выделения кислорода, так и на перенос электрона на акцепторной стороне ФС II. El-Shintinawy и Govindjee [21] показали на клетках зеленой водоросли C. reinhardtii, что кроме известного места действия бикарбоната на уровне переноса электрона от QA к QB существует и другой участок, локализованный, как они предполагали, между вторичным донором электрона ФС II (Z) и Qa.
Известно, что в ряду других компонентов фотосинтетического аппарата ФС II наиболее уязвима к инактивирующим воздействиям, в том числе к действию повышенных температур [22-24]. Среди отдельных реакций, происходящих в ФС II, процесс фотосинтетического выделения кислорода, осуществляемый Mn-содержащим ВОК, является особенно чувствительным к инактивирую-
щему действию повышенных температур [23, 25-27]. Поэтому именно устойчивость ВОК к термоинактивации во многом определяет термоустойчивость процесса фотосинтеза в целом. Nash с соавт. [28] показали, что тепловая инактивация функции фотосинтетического выделения кислорода связана с выходом ионов Mn2+ из ВОК ФС II.
В этой статье мы использовали процедуру тем-новой термоинактивации для того, чтобы выяснить, предохраняет ли бикарбонат ВОК ФС II при термоинактивации in vivo в целых клетках зеленой водоросли C. reinhardtii.
МЕТОДИКА
Клетки дикого типа зеленой одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii выращивали на питательной агаровой среде, содержавшей ацетат натрия в качестве источника углерода, как описано ранее [29], при температуре 22°C и непрерывном освещении белым светом от люминесцентных ламп (15 Вт/м2). Клетки собирали в конце логарифмической фазы роста с помощью низкоскоростного центрифугирования (600 g) в
течение 10 мин. Удаление HCO33 /СО2 из клеток C. reinhardtii проводили, как описано ранее [10, 11] посредством разбавления (более, чем в 250 раз) полученного концентрированного осадка клеток в среде А, истощенной по HCO3 /СО2 и содержавшей 100 мМ Mes-NaOH-буфер (pH 6.5) и 35 мМ NaCl, до достижения конечной концентрации по хлорофиллу около 10 мкг/мл, что соответствует примерно 1 X 107 клеток в 1 мл. Для истощения среды А ее продували в течение не менее, чем 60 мин воздухом, не содержавшим CO2, для чего воздух предварительно пропускали через 50%-ный раствор NaOH и 20-сантиметровый слой аскарита. Клетки считали с помощью медицинского гемоцитометра. Концентрацию хлорофилла определяли по методу, описанному ранее [30], в 80%-ном ацетоновом экстракте.
Скорость фотосинтетического выделения кислорода суспензией клеток C. reinhardtii измеряли полярографически в 1-миллилитровой ячейке с помощью электрода Кларка при непрерывном освещении красным светом насыщающей интенсивности (к > 600 нм, 55 Вт/м2) и температуре 22°С. В качестве акцепторов электрона использовали комбинацию 0.5 мМ 2,6-дихлор-р-бензохи-нона (ДХБХ) и 1 мМ K3Fe(CN)6. Пара указанных акцепторов электрона принимает электроны от ФС II, причем липофильный акцептор ДХБХ действует в качестве интермедиата, передающего электроны от ФС II на конечный акцептор -K3Fe(CN)6. Перенос электронов между пулом пластохинонов и ФС I и, следовательно, процесс фиксации СО2 блокировали с помощью 20 мкМ
2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-р-бензохинона, как описано ранее [31]. Скорость фотосинтетического выделения кислорода определяли по наклону экспериментальной кривой за первые 20 с освещения. Клетки С. reinhardtii, которые были ресуспендированы в среде А, содержавшей 5 мМ бикарбоната, и не подвергались термоинактивации, выделяли кислород со скоростью порядка 210 мкмоль/(мг хлорофилла ч). Далее все измерения фотосинтетического выделения кислорода проводили в этих условиях. Результаты представлены в виде процента от контроля для удобства сравнения данных, полученных в разных экспериментах.
Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла (АФ) с X > 660 нм, связанные с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС II, пластохинона QA, измеряли в 1-сантиметровой кварцевой кювете с помощью фосфороскопической установки, как описано ранее [32].
Термоинактивацию проводили при температуре 45°С в полной темноте внутри водного термостата TGL-U4 ('^ЕВ", Германия). Суспензию клеток в среде А, в отсутствие добавок или в присутствии 5 мМ №НС03 в тех случаях, где это указано, помещали в термостат в плотно закрывающихся, полностью заполненных образцом пробирках. Сразу после термоинактивации при температуре 45°С температуру суспензии клеток доводили до 22°С, помещая пробирки с клетками на короткое время в камеру второго водного терм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.