научная статья по теме БИОАНОД ДЛЯ МИКРОБНОГО ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПОЛИМЕРНУЮ МАТРИЦУ Химия

Текст научной статьи на тему «БИОАНОД ДЛЯ МИКРОБНОГО ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПОЛИМЕРНУЮ МАТРИЦУ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 570-577

УДК 577.23:620.95

БИОАНОД ДЛЯ МИКРОБНОГО ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ Gluconobacter oxydans, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПОЛИМЕРНУЮ МАТРИЦУ

© 2014 г. С. В. Алфёров*, П. Р. Минайчева*, В. А. Арляпов*, Л. Д. Асулян*, В. А. Алфёров*, О. Н. Понаморёва*, А. Н. Решетилов**

*Тульский государственный университет, Тула, 300012 **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, 142290

e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 11.03.2014 г.

Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 иммобилизовали в синтетическую матрицу на основе поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидо-ном, и использовали в качестве биокатализатора при разработке биоанодов для микробных топливных элементов. Данный способ иммобилизации не оказывал значительного влияния на субстратную специфичность бактерий. Биоаноды на основе иммобилизованных бактерий стабильно функционировали в течение 7 сут. Максимальное значение напряжения (сигнала топливного элемента) достигалось при внесении в анодное пространство 110—130 мкМ медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола. Сигналы топливного элемента достигали максимума при концентрации глюкозы выше 6 мМ. При использовании в качестве топлива отходов бродильных производств удельная мощность лабораторной модели микробного топливного элемента на основе разработанного биоанода достигала 7 мВт/м2.

DOI: 10.7868/S0555109914060026

Микробный топливный элемент (МТЭ) является экологически чистым альтернативным источником электрической энергии, в котором в качестве биокатализаторов используются микроорганизмы [1—4]. Создание МТЭ предполагает наличие систем, способных стабильно функционировать длительное время. Эта задача решается путем иммобилизации клеток микроорганизмов с повышенной стабильностью на поверхности анода топливного элемента, при которой стабильность увеличивается. В настоящее время создание МТЭ с иммобилизованным биокатализатором на аноде включает процесс формирования на поверхности электрода биопленок [5—7] и закрепление микроорганизмов с помощью синтетических носителей, например золь-гель матриц [8], углеродных наночастиц [9]. Для создания биопленок чаще всего применяют бактерии родов ОеоЬас1ег и 8Нвмапв11а, так как они способны к прямому переносу электронов (так называемые электроактивные биопленки). Однако для образования стабильной биопленки из одной или смеси культур, как правило, требуется от нескольких недель до нескольких месяцев [10]. Для увеличения эффективности передачи электронов в таких системах были предприняты попытки иммобилизации бактериальных клеток в матрице из углеродных наночастиц. При этом удалось увеличить удельную мощность МТЭ до 1.95 мВт/м2 по срав-

нению с биопленкой на не модифицированном аноде (1.48 мВт/м2) [9].

При использовании сетчатых полимеров для иммобилизации микроорганизмов на поверхности электрода не требуется формирования биопленки. Так, в работе [8] проводили иммобилизацию клеток бактерий 8Нец>апе11а oneidensis на графитовый войлок при помощи кремнийоргани-ческой золь-гель матрицы. Аноды, на основе этих матриц сохраняли свои параметры без изменений более 5 сут. При этом максимальная мощность МТЭ составляла 3.6 Вт/м2 и была выше, чем для МТЭ на основе адсорбированных клеток бактерий (2.4 Вт/м2). Перспективным методом иммобилизации клеток микроорганизмов в биосенсорных анализаторах является включение их в гель на основе поливинилового спирта (ПВС). ПВС — химически стабилен, нетоксичен и биосовместим [11, 12], что обусловливает эффективное использование полимера в качестве матрицы для иммобилизации. Однако ПВС мало пригоден для иммобилизации микроорганизмов на графитовых электродах топливного элемента, поскольку обладает низкой механической прочностью. Известны методы получения механически устойчивых гелей ПВС с использования УФ-облучения [12], воздействия борной кислотой [13] и сополи-меризации с М-винилпиридином [14]. Эти мето-

Рис. 1. Схема функционирования микробного медиаторного топливного элемента. 1 — биоанод, 2 — протон-селективная мембрана, 3 — катод, 4 — внешнее сопротивление, 5 — субстрат, 6 — бактерия, 7 — продукты окисления. (Мох и Мге(1 окисленная и восстановленная формы медиатора соответственно).

ды сопряжены с использованием реагентов или условиями реакций, оказывающих негативное влияние на живые микроорганизмы и приводящих к снижению энергетических характеристик МТЭ. Модификация ПВС М-винилпирролидо-ном ^-ВП) позволила получить новый вариант иммобилизацованных клеток микроорганизмов с улучшенными свойствами [14]. М-ВП не только практически нетоксичен, но и повышает активность некоторых микроорганизмов [15]. Кроме того, такая модификация носителя улучшает механические свойства матрицы и способствует повышению сорбции клеток на поверхности графитового электрода [16].

Несмотря на то, что в МТЭ наиболее часто используются бактерии, способные к прямому переносу электронов посредством пилей или эндогенных медиаторов, перспективными микроорганизмами, на основе которых возможно создание биоанода топливного элемента, могут стать бактерии О1исопоЬа&вг охуёат 8иЪ8р. тёш-Миз ВКМ В-1280 [17]. Этот микроорганизм обладает уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся мембранной локализацией основных ферментов клеточного метаболизма — дегидрогеназ, что обеспечивает доступ субстрата к активным центрам ферментов [18].

В данном случае сопряжение ферментативной и электрохимической реакций, то есть обеспечение активного транспорта электронов с бактериальной цепи переноса электронов на электрод, достигается при использовании искусственных переносчиков электронов — экзогенных медиаторов (рис. 1) [19]. Ранее было установлено, что в модели МТЭ на основе бактерий О. охуёат наиболее эффективным медиатором электронного транспорта является 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИФ) [20]. Предварительно было показано, что электрод, полученный таким методом, обладал улучшенными характеристиками, что позволяло использовать его при создании биоанода МТЭ.

Цель работы — иммобилизация бактерий О. оху-ёат в матрицу модифицированного поливинилового спирта и изучение характеристик полученного биоанода.

МЕТОДИКА

Культивирование клеток микроорганизмов. В

работе использовали бактерии О. охуёат 8иЪ8р. тёшМш ВКМ В-1280 из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН. Культивирование бактерий проводили в течение 18 ч при 28°С на питательной среде (100 мл) следующего

состава (г/л): D-сорбит — 200 и дрожжевой экстракт — 20, pH среды — 5.2—5.5. Рост бактерий регистрировали на спектрофотометре СФ-103 ("Аквилон", Россия), измеряя зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени культивирования. Определение оптической плотности суспензии проводили при 540 нм и толщине кюветы 1 см, в качестве контроля использовали дистиллированную воду. Измерения повторяли каждые 2 ч в течение 2 сут. Клетки отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g на центрифуге Avanti J-30I ("Beckman Coulter", США) и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6.0. Затем клетки ресуспендировали в том же буфере и отделяли в течение 10 мин при 12000 g на центрифуге Eppendorf 5417 C/R ("Eppendorf", Германия). Полученные клетки высушивали на воздухе. В качестве биокатализатора в биотопливном элементе использовали клетки на различных стадиях роста, разбавленные в 30 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6.0 в соотношении 1 : 3 (мг сырой биомассы/мкл).

Формирование ячейки биотопливного элемента.

Ячейка биотопливного элемента представляла собой две взаимосвязанные кюветы. Рабочий объем анодного отделения был равен объему катодного и составлял 3 мл. В качестве электродов использовали спектрографические графитовые стержни диаметром 8 мм (СЭУ, Научно-исследовательский институт электроугольных изделий, Россия) с площадью рабочей поверхности 300 мм2. Глубина погружения электродов в раствор — 10 мм. Анодное и катодное отделения разделены протонселек-тивной мембраной МФ-4СК ("Пластполимер", Россия) диаметром 6 мм, которая является аналогом мембраны Nafion 117 в протонированной форме. В качестве фонового раствора использовали 30 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0, а в качестве медиатора — 2,6-ДХФИф ("Sigma Aldrich", Германия). Для оценки каталитической эффективности бактерий G. oxydans, наряду с 2,6-ДХФИФ в анодном отделении, в катодном отделении использовали гексацианоферрат (III) калия (3 мМ). В качестве субстратов использовали (10 мМ): глюкозу, галактозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, этанол, пропанол-1, бутанол-1, пропанол-2, глицерин и сорбит.

Все реактивы имели степень чистоты х. ч. или ч. д. а.

Иммобилизация бактерий G. oxydans. Модификацию поливинилового спирта (марка 16/1, Россия) проводили в соответствии с методом, описанным в работе [15]. К 20 мл 5%-ного водного раствора ПВС добавляли при постоянном перемешивании 0.8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH4)2Ce(NO3)6 (0.1 г/мл) и 0.1 мл N-винилпирролидона. Реакцию проводили в ат-

мосфере азота в течение 3 ч при 40°С. К 200 мкл раствора модифицированного ПВС добавляли 3, 10, 30, 60, 80, 100 мг клеток G. oxydans, тщательно перемешивали и полученную суспензию наносили на графитовый электрод (высота нанесения 1 см). Затем электрод с иммобилизованными клетками оставляли на 24 ч при 4°C.

Обработка графитовых электродов концентрированной азотной кислотой. Графитовые электроды помещали в 50 мл азотной кислоты (р = 1.35 г/мл) и выдерживали в течение 15 мин при 78—80°C. Затем электроды отмывали дистиллированной водой до достижения постоянной разности потенциалов между анодом и катодом, равной 0—10 мВ.

Электрохимические измерения. Измерения потенциала проводили при помощи гальванопотен-циостата IPC Micro (НТФ "Вольта", Россия), входное сопротивление которого составляло 1013 Ом. Измерения проводили в 30 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6.0, при постоянном перемешивании магнитной мешалкой (400 об./мин). Регистрацию ответов после добавления субстр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком