ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 654-658
УДК 579.222.2+579.252.5
БИОДЕГРАДАЦИЯ ФЕНАНТРЕНА РИЗОСФЕРНЫМИ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИМИ БАКТЕРИЯМИ РОДА Pseudomonas В МОДЕЛЬНЫХ РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЯХ
© 2004 г. Т. О. Анохина*, В. В. Кочетков**, Н. Ф. Зеленкова**, В. В. Балакшина**, А. М. Воронин**
*Пущинский государственный университет, г. Пущино, Московская обл., 142290;
e-mail: to_anohina@rambler.ru **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, Московская обл., 142290; e-mail: kochet@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 18.12.2003 г.
Исследована способность природных и трансконъюгантных плазмидосодержащих ризосферных штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов Pseudomonas fluorescens и P. aureofaciens утилизировать фенантрен в почве в модельных растительно-микробных ассоциациях. Показано, что фиторемедиация почвы, загрязненной фенантреном в отсутствие штаммов-деструкторов, в ризосфере ячменя (Hordeum sativum L.) неэффективна. Инокуляция семян ячменя как природными, так и трансконъгантными плазмидосодержащими штаммами Pseudomonas, способными к деградации полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), защищала растения от фитотоксичного действия фенантрена, и способствовала его эффективной деградации в почве. Показана возможность использования рапса (Brassica napus L.) в качестве индикаторного растения, чувствительного к фенантрену для определения эффективности его деградации в почве. Методика биотестирования с использованием чувствительных растений рапса может быть рекомендована для оценки эффективности фито/биоремедиации почв, загрязненных ПАУ.
Необходимость борьбы с загрязнением почв полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) обусловлена как их широким распространением, так и токсичными, мутагенными и канцерогенными свойствами. Концентрация ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен, хризен и т.д.) в почвах может достигать весьма больших величин [1].
Одним из перспективных подходов очистки почв от разнообразных ксенобиотиков является фи-то/биоремедиация - использование растений и ассоциированных с ними микроорганизмов. Растения способны поглощать и метаболизировать ряд органических соединений, включая продукты уничтожения химического оружия, пестициды, гербициды, полихлорированные фенолы, трихлорэтилен и ПАУ [2, 3]. В клетках растений органические компоненты могут подвергаться частичной или полной деградации, трансформироваться в менее токсичные соединения или связываться с нерастворимыми клеточными структурами, такими как лигнин [4]. Однако только немногие соединения полностью минерализуются растениями до воды и углекислого газа, и даже там, где этот процесс происходит, он составляет небольшой процент от первоначального содержания ксенобиотиков [3]. Микроорганизмы, в отличие от растений, способны к полной деграда-
ции различных органических веществ. Показано, что эффективность деградации ПАУ при совместном применении растений и ризосферных микроорганизмов существенно повышается. Растения в процессе своего роста выделяют в виде корневых экссудатов до 35% ассимилированного углерода [5], что поддерживает рост и метаболическую активность микробных популяций. Некоторые штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas способны стимулировать рост растений за счет синтеза фито-гормонов и улучшения минерального питания растений, а также защищать их от фитопатогенов, синтезируя различные антибиотики, сидерофоры и цианистый водород [6].
Цель работы - изучение способности природных и трансконъюгантных плазмидосодержащих штаммов Pseudomonas утилизировать фенантрен в модельных растительно-микробных ассоциациях и разработка метода биотестирования эффективности фито/биоремедиации ПАУ с использованием индикаторных растений, чувствительных к фенантрену.
МЕТОДИКА
Бактериальные штаммы и условия культивирования. Штаммы, использованные в работе,
Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
Штамм Фенотип Источник
P. aureofaciens
BS1393(pBS216) Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2МепаГ Phz+ ИБФМ РАН**, [8]
OV17* Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2Menah+ Phz+ Настоящая работа
P. fluorescens
38a(pBS216) Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2Мепа^ Phz- ИБФМ РАН**
IC7* Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2МепаГ Phz+ Настоящая работа
OV29* Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2Мепа^ Phz- »
OV25* Phe+ Nah+ Flu+ Ace+ Sal+ 2Menah+ Phz- »
Примечания. Способность к росту на: Phe+ - фенантрене, Nah+ - нафталине, Flu+ - флюорене, Ace+ - аценафтене, Sal+ - са-лицилате, 2Menah+ - 2-метилнафталине; Phz+ - способность синтезировать феназиновые производные.
* Природные штаммы, содержащие плазмиды биодеградации нафталина/фенантрена. ** Коллекция лаборатории биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
представлены в табл. 1. Плазмидосодержащие штаммы OV17, OV25, OV29 и IC7 были выделены из ризосферных образцов почв Западной Сибири, загрязненных углеводородами нефти.
Идентификацию штаммов проводили с помощью рестрикционного анализа гена 16S рРНК. Фрагмент гена 16S рРНК выделенных и типовых штаммов амплифицировали с использованием праймеров 27fm (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') and 1492r (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3') согласно [7]. Типовые штаммы P. aure-ofaciens B-1249 и P. fluorescens B-894 (T) получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили при 37°С (HinfI, HhaI, MspI, Rsal) и при 60°C (TaqI) и сравнивали рестрикционные профили штаммов между собой.
Трансконъюгантные варианты штаммов BS1393 и 38а, способные к использованию ПАУ в качестве единственных источников углерода и энергии, были получены в результате конъюгационного переноса плазмиды деградации нафталина pBS216 из донор-ного штамма P. putida BS590(pBS216) [8].
Бактерии выращивали при 28°С на агаризо-ванной среде М9 или в L-бульоне [9]. Проверку способности микроорганизмов к деградации различных ароматических углеводородов (нафталин, фенантрен, флюорен, аценафтен и 2-метил-нафталин) проводили на агаризованной среде М9 в парах этих ПАУ в качестве единственных источников углерода и энергии. Салицилат натрия добавляли в среду из расчета 500 мг/л.
Торфо-песчаная смесь. Приготовленную смесь (соотношение торфа и песка 3 : 1, рН водной вытяжки 6.2) стерилизовали прокаливанием при 120°С в течение 3 ч. Фенантрен добавляли в сухом виде до конечной концентрации 5 мг/г смеси и тщательно перемешивали. Торфо-песчаную смесь с фе-нантреном раскладывали по 300 г в пластиковые со-
суды и поливали 100 мл водопроводной воды (влажность около 40%).
Выращивание растений. Ячмень (Hordeum sativum L., сорт Зазерский 85) и рапс (Brassica napus L., сорт Ханна шведской селекции) были выбраны в качестве устойчивого и чувствительного растения к концентрации фенантрена 5 мг/г соответственно. Семена ячменя инокулировали в течение
2 ч суспензией штаммов, взятых в экспоненциальной фазе роста (плотность 108 КОЕ/мл). В 1 сосуд сеяли 30 семян ячменя. Через 4 сут после появления проростков оставляли по 20 растений/сосуд. Контролем служили растения, выросшие на тор-фосмеси без внесения фенантрена и без бактеризации (семена растений не инокулировали ризо-сферными бактериями). Растения поливали через 1 сут 100 мл водопроводной воды. Высоту 30 растений измеряли на 4, 14 и 28 сут. Через 28 сут ячмень удаляли из сосудов, и в эту же торфо-смесь сеяли по 30 семян рапса, которые также выращивали 28 сут. По окончанию эксперимента измеряли вес сухих 30 растений рапса. Растения выращивали при естественном температурном и световом режиме со среднесуточной температурой 25 °С. Время проведения эксперимента - июль-август.
Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов в ризосфере ячменя определяли на 4, 14, 28 сут согласно [10].
Определение содержания фенантрена в тор-фо-песчаной смеси. Отбор образцов и определение содержания фенантрена в ризосфере проводили на 28 сут эксперимента после удаления ячменя. Навеску торфо-песчаной смеси массой 1 г экстрагировали 20 мл метанола в течение 1 сут при интенсивном перемешивании.
1 мл метанольного экстракта центрифугировали (микроцентрифуга "Beckman", США) в течение
3 мин для удаления механических примесей. Анализ концентрации фенантрена проводили с помощью ВЭЖХ. Экстракт почвенных образцов в
см 35
30
25
20
15
10
5
0
□ 4 сут
□ 14 сут
□ 28 сут
1 2 3 4 5
6
7 8
Рис. 1. Влияние инокуляции семян ячменя фенантрен-деградирующими штаммами ризосферных бактерий на рост растений (см) в торфосмеси, содержащей 5 мг/г фенантрена. 1 - контроль, небактеризованные растения без добавления фенантрена, 2 - небактеризованные растения с фенантреном, 3 - Б81393(рБ8216), 4 -38а(рБ8216), 5 - 1С7, 6 - ОУ29, 7 - ОУ17, 8 - ОУ25.
объеме 25-200 мкл наносили на колонку и проводили анализ в следующих условиях: обращенно-фазная колонка Nucleosil С-18 (3 мкм, 4.6 х 125 мм, "Marcherey-Nagel", США); предколонка - HPLC Column ("Serva", США); носитель - октадецил Si-60 (20-40 мкм, 4.6 х 75 мм); элюент - 83% метанола, деионизованная дистиллированная вода; длина волны детектирования - 254 нм; скорость протока - 0.8 мл/мин; температура колонки - 50°С. Анализ проводили на жидкостном хроматографе высокого давления (модель 2150, "LKB", Швеция). Регистрацию пиков поглощения фенантрена производили с помощью интерфейса Nelson Analytical 900 и PC Olivetty M-24 ("Hewlett-Packard", США). Обработку результатов осуществляли при помощи пакета прикладных программ "Nelson Analytical". Расчет концентраций фенантрена производили по площади пика по сравнению с площадью пика контрольного образца. Повтор-ность всех экспериментов трехкратная.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Концентрацию фенантрена в почве можно определять с помощью различных аналитических методов, например жидкостной хроматографии высокого давления и спектрофлюориметричес-кого метода. Однако проведение такого рода анализов требует дорогостоящего оборудования и не всегда возможно при проведении фито/биор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.