УДК 579.262:579.6
ВИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ МИКРОБНО-РАСТИТЕЛЬНЫМИ АССОЦИАЦИЯМИ
© 2015 г. А. А. Иванова, А. А. Ветрова, А. Е. Филонов, А. М. Воронин
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290 e-mail: mrs.ivanova.a.a@gmail.com Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Изучены деградация углеводородов нефти растительно-микробными ассоциациями, а также особенности взаимодействия между участниками процесса — микроорганизмами в составе консорциума и растениями, с которыми они ассоциированны. Показано, что микроорганизмы-деструкторы, входящие в состав консорциума: Rhodococcus erythropolis S26, Acinetobacter baumannii 1B, Acinetobacter baumannii 7 и Pseudomonasputida F701, эффективны в отношении деградации нефти и являются хорошими колонизаторами корней растений (ячменя). При совместном применении ассоциации микроорганизмов и растений эффективность деградации нефти возрастала.
Ключевые слова: микроорганизмы, биодеградация нефти, микробно-растительная ассоциация. DOI: 10.7868/S0555109915020063
Добыча нефти является одной из важнейших отраслей промышленности в Российской Федерации. При ежегодной добыче нефти 400 млн т, объем утечек может достигать 15 млн т в год. Сырая нефть содержит сотни различных химических компонентов, процентное содержание которых колеблется в широких пределах и зависит от особенностей нефтяных месторождений. Более 75% состава нефти приходится на углеводороды, остальную часть составляют производные углеводородов, в которых содержится сера, азот и кислород. Углеводороды нефти делятся на парафины, циклопарафины (нафтены), ароматические и нафтеноароматические углеводороды [1].
Нефтяные углеводороды подвержены деградации в результате химического и фотоокисления, но основную роль в их разложении играют микроорганизмы. Однако не существует ни одного вида микроорганизмов, способного осуществлять деградацию всех компонентов сырой нефти, поэтому для их полной деструкции требуется участие целого ряда микроорганизмов-деструкторов различных таксономических групп.
В технологии фиторемедиации помимо растений используются ассоциированные с ними микроорганизмы. В настоящее время известно, что главную роль в деградации токсикантов в процессе фиторемедиации играют микроорганизмы ризосферы растений. В ризосфере растений обычно присутствуют штаммы бактерий, так называемые PGPR-штаммы (plant growth promoting rhizobacte-ria), стимулирующие рост растений. Однако по-
добные штаммы, как правило, не способны к утилизации углеводородов нефти. Поэтому основной задачей при разработке методов фиторемедиации является в первую очередь поиск эффективных уг-леводородокисляющих микроорганизмов, способных к колонизации ассоциированных с ними растений.
В настоящее время существуют многочисленные экспериментальные данные [1], наглядно демонстрирующие способность растений противостоять токсичному действию чужеродных веществ за счет таких процессов, как экскреция; конъюгация токсичных соединений с внутриклеточными соединениями с дальнейшей компартментализа-цией конъюгатов и деградация токсикантов до стандартных клеточных метаболитов и углекислого газа [1].
Ранее нами в результате последовательного использования двух подходов была получена микробная ассоциация. Первый из них включает в себя анализ физиологических, метаболических и деструктивных свойств микроорганизмов с последующим их комбинированием, а также, оценку наличия плазмид в штаммах бактерий. Второй — представляет собой селекцию смешанной ассоциации наиболее активных микроорганизмов при периодическом культивировании в жидкой минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Критериями отбора являлась способность микроорганизмов утилизировать до 30% углеводородов нефти в присутствии №С1 при 2—42°С и рН 4—10, способность
продуцировать биоэмульгаторы, а также наличие катаболических плазмид в бактериальных клетках. Это позволило создать микробную ассоциацию, в состав которой вошли 4 микроорганизма: Rhodococcus erythropolis S26, Acinetobacter baumannii 1B, A. baumannii 7 и Pseudomonas putida F701 [2].
Цель работы — изучение растительно-микробных ассоциаций на основе отобранных штаммов и возможности их применения в процессе фито-ремедиации.
МЕТОДИКА
Бактериальные штаммы. Ассоциация микроорганизмов-деструкторов, которая включала R erythropolis S26, A. baumannii 1B, A. baumannii 7 и P.putida F701 (далее ассоциация), выделена из нефтезагряз-ненных почвенных образцов [2, 3]. Все штаммы обладали способностью к деградации углеводородов нефти в диапазоне температур 4—42°С [2].
Питательные среды. Бактерии выращивали на полноценных питательных средах: жидкой ЛБ и ЛБ с добавлением 2% агара [4], содержащих (г/л): бакто-триптон ("Difco", США) — 10.0, дрожжевой экстракт ("Difco") - 5.0 и NaCl - 10.0.
В качестве жидкой минерально-солевой среды для бактерий использовали среду Эванса [5] , содержащую 50 мМ K2HPO4, 5мМ NH4Cl, 0.1 мМ Na2SO4, 0.062 мММ§С12, 1мкМ CaCl2, 0.005 мкМ (NH4)6Mo7O24 • 4H2O. В среду вносили 1мл/л раствора микроэлементов. Состав раствора микроэлементов в 1%-ном HCl, (г/л): ZnO - 0.41, FeC13 • • 6H2O - 0.54, MnCl2 ■ 4H2O- 2.00, CuCl2 ■ 2H2O-0.17, CoCl2 6H2O - 0.48, H3BO3 - 0.06, pH среды 7.0-7.2.
Для получения агаризованных сред добавляли 20 г/л агара ("Pronadisa", Испания). Выращивание микроорганизмов на агаризованной минеральной среде с использованием дизельного топлива или нафталина в качестве единственного источника углерода и энергии проводили в парах этих веществ. Для приготовления сред с диспергированным углеродным субстратом (нефть) использовали ультразвуковой дезинтегратор MSE-150B (Великобритания). Для этого в колбы объемом 300 мл вносили 150 мл минимальной среды Эванса, добавляли 3 г агара и 1.5 г нефти. После стерилизации, еще горячую среду диспергировали на ультразвуковом дезинтеграторе при максимальной амплитуде в течение 3 мин. При неудовлетворительной степени дисперсности субстрата процесс повторяли несколько раз. Полученную таким образом агаризованную среду с диспергированным углеводородным субстратом разливали в чашки Петри. Посев проводили так же, как и на стандартные агаризованные среды [6].
Семена ячменя стерилизовали 5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 3 ч, затем промывали 4 раза стерильной водопроводной водой в течение 2 ч. Контроль стерильности семян проводили на чашках Петри с ЛБ-агаром в течение 18-20 ч при 24°С.
Для выращивания растений использовали закрытые гнотобиотические системы [7], представляющие собой закрытые пластиковые сосуды (77 х х 77 х 97 мм) Magenta vessel ("Sigma", США), содержащие 150 г стерильного песка. В сосуды вносили 2% нефти. Стерильные проростки ячменя помещали в сосуды после интродукции микроорганизмов. В качестве минерального питания растений использовали среду "Murashige and skoog basal salt" ("Sigma", США).
Для приготовления "открытых" нестерильных модельных почвенных систем использовалась взятая у р. Ока вблизи г. Пущино Московской обл. лугово-аллювиальная почва следующего состава (на 100 г почвы): 2.75% углерода, 4.74% гумуса, 225 мг общего азота, 500 мг P2O5, и 16.88 мг K2O, рН водной вытяжки — 8.16. Перед использованием почву просеивали через сито с диаметром отверстий 2.0 мм. Затем почву (500 г) тщательно перемешивали с нефтью (10 г). Приготовленную таким образом модельную почву помещали в пластиковые горшки (толщина слоя почвы 10 см) и инкубировали при 18—25°С.
В качестве биогенных источников азота, фосфора и калия использовали минеральное удобрение (1.5 г на 500 г почвы) "Нитроаммофоска" (ООО "Фаско+", Россия).
Условия выращивания растений. Растения (ячмень) выращивали при 20°С в следующем режиме: 12-ч световой период и 12-ч темновой период. Через 10 и 14 сут (закрытый и "открытый" нестерильный модельный эксперимент соответственно) проводили смывы с корней и из ризосферы физиологическим раствором. Далее делали высев из полученной суспензии на ЛБ-агар для качественного и количественного анализа бактерий. В условиях проведения "открытого" эксперимента влажность почвы поддерживали на постоянном уровне (15%) стерильной водопроводной водой.
Интродукция микроорганизмов-деструкторов в модельные системы. В модельных экспериментах суспензию микроорганизмов (1.5 х 106 КОЕ/г песка или почвы) вносили в песок/почву вместе с минеральной средой (в случае закрытого эксперимента) и вместе с минеральными удобрениями (в случае "открытого" нестерильного эксперимента).
Закрытый модельный эксперимент. Для изучения взаимодействия штаммов-деструкторов с растениями и оценки деградации нефти использовали следующие модельные системы, представленные на рис. 1. Для контроля абиотической убыли загрязнителя использовалась система с
нефтью без микроорганизмов и без растений. Оценку РОРЯ-свойств бактерий проводили в системе, содержащей растения и ассоциацию микроорганизмов (рис. 1а, система 8). Эффективность биодеградации нефти оценивали в системах с нефтью и микроорганизмами (рис. 1б, системы 3—9).
Через 10 сут эксперимента оценивали токсический эффект нефти на растения, убыль нефти за счет деградации каждым штаммом, и в присутствии растений, степень деструкции нефти ассоциацией микроорганизмов, защитный эффект в отношении растений каждым из штаммов и ассоциацией микроорганизмов, а также количество микроорганизмов на корнях (в ризоплане) и в ризосфере.
"Открытый" модельный эксперимент. Поскольку в условиях "открытого" нестерильного эксперимента растения прорастали и развивались медленно, эксперимент проводили в течение 14 сут, ориентируясь на длину побегов.
Через 14 сут эксперимента оценивали токсический эффект нефти на растения, влияние ассоциации микроорганизмов на растения, убыль нефти при использовании растительно-микробной ассоциации, убыль нефти при использовании растительно-микробной ассоциации в присутствии минеральных удобрений (нитроаммофоски), количество микроорганизмов на корнях (в ризоплане) и в ризосфере, влияние внесенных удобрений на процесс деградации нефти и на количество микроорганизмов.
Численность микроорганизмов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.