ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2015, том 57, № 2, с. 148-153
МЕДИЦИНСКИЕ = ПОЛИМЕРЫ
УДК 541(49+64):547.963.32
БИОДЕГРАДИРУЕМЫЕ МУЛЬТИЛИПОСОМАЛЬНЫЕ КОНТЕЙНЕРЫ1
© 2015 г. А. А. Ефимова*, А. В. Сыбачин*, С. Н. Чвалун**, А. И. Кулебякина**,
Е. В. Козлова**, А. А. Ярославов*
* Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы ** Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 1 Поступила в редакцию 05.11.2014 г. Принята в печать 05.12.2014 г.
Описан способ получения биодеградируемых мультилипосомальных контейнеров путем модификации анионных липосом катионным полимером и последующей адсорбции полученного катион-ного комплекса липосома—полимер на поверхности отрицательно заряженных полилактидных мицелл с привитыми полиоксиэтиленовыми цепями. Липосомы сохраняют свою целостность в тройном комплексе мицелла—поликатион—липосома, что позволяет использовать такой комплекс в качестве мультилипосомального контейнера для инкапсулирования биологически активных веществ.
БО1: 10.7868/82308113915020059
Бислойные липидные везикулы (липосомы) применяются в качестве контейнеров для доставки биологически активных веществ (БАВ): лекарств [1—3], полипептидов и белков [4—6], нуклеиновых кислот [7—9] и т.д. Концентрирование нескольких десятков липосом, заполненных различными БАВ, в небольшом объеме, например путем их иммобилизации на коллоидном носителе нанометрового размера, может привести к повышению эффективности поглощения липосом клетками и к увеличению терапевтического эффекта липосомального препарата. Однако закрепление липосом на твердом носителе обычно сопровождается их разрушением и неконтролируемым выходом инкапсулированного вещества. Описанные в литературе немногочисленные удачные примеры иммобилизации нативных (неразрушенных) липосом предполагают проведение достаточно сложных процедур предварительной модификации как липосом, так и поверхности [10]. Это заставляет обратиться к поиску новых подходов к иммобилизации липосом, лишенных указанных выше недостатков.
Недавно нами был предложен способ иммобилизации анионных липосом на поверхности сферических поликатионных щеток — полисти-рольных микросфер с привитыми поликатион-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (код проекта 14-13-00255).
E-mail: ephimova@genebee.msu.su (Ефимова Анна Александровна).
ными цепями [11]. Было показано, что на поверхности поликатионных щеток можно адсорбировать смесь липосом, наполненных веществами разной химической природы [12]. Такой способ позволяет концентрировать на поверхности значительные количества липосом, не нарушая при этом их целостности. Разрушению липосом препятствует гидрофильный слой привитых макромолекул, который предотвращает непосредственный контакт иммобилизованных липосом с твердой поверхностью по-листирольного ядра. Полученные нами мульти-липосомальные контейнеры представляют интерес для создания многоцелевых катализаторов и флуоресцентных маркеров. Медицинское применение таких контейнеров ограничено тем, что ядро контейнера (полистирольная микросфера) не подвергается деградации в организме.
В настоящей работе в качестве биодегради-руемой основы липосомальных контейнеров использованы мицеллярные наночастицы по-лилактида (ПЛА), стабилизированные макромолекулами полиэтиленгликоля [13]. Липосомы электростатически адсорбировали на поверхности полилактидного ядра. Полилактид подвергается деструкции под действием гидролитических ферментов (эстераз) [14, 15], что придает биодеградируемость всей конструкции ПЛА—липосома.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Кардиолипин (КЛ) и фосфатидилхолин (ФХ) фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки.
Поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭП) получали исчерпывающим алкилированием по-ли-4-винилпиридина бромистым этилом. Использовали фракцию поли-4-винилпиридина со средневесовой степенью полимеризации 600. Согласно данным ИК-спектроскопии [16], степень алкилирования составляла 95%.
Полилизина гидробромид со степенью полимеризации 340 производства "Sigma" (США) применяли без дополнительной очистки.
Триблок-сополимер поли-Х-лактида и поли-этиленгликоля (ПЛА—ПЭГ—ПЛА)
CH3
H
-O.
O m
H2
O'^C^]
H2J
O.
CH3 CH
C O
OH
(т = 52, п = 91) получали путем полимеризации лактида с раскрытием цикла, в качестве катализатора использовали октаноат олова [17]. Чистоту и строение полученных образцов подтверждали методом ЯМР, ГПХ и ИК-спектроскопии. Блок-сополимеры растворяли в тетрагидрофуране, через 1 сутки в раствор добавляли по каплям дистиллированную воду до содержания воды 10 об. %, еще через 1 сутки содержание воды в растворе доводили до 20 об. %. Водно-органическую смесь диализо-вали в течение недели относительно воды для удаления органического растворителя. В результате были получены водные дисперсии сополимера с концентрацией макромолекул 3 х 10-5 моль/л.
Липосомы из электронейтрального ФХ и анионного КЛ2- с мольной долей анионных групп ф = 0.1 формировали с использованием стандартной методики [18]. Соответствующие объемы растворов липидов в органическом растворителе смешивали в стеклянной колбе. После удаления растворителя под вакуумом липидную пленку диспергировали в 10-2 М ТРИС-буферном растворе с рН 7 и дополнительно гомогенизировали ультразвуковой обработкой.
Липосомы с заключенным во внутренний объем хлоридом натрия получали по описанной выше стандартной методике, но липидную пленку диспергировали в 1 М растворе №С1 в ТРИС-бу-фере. Суспензию диализовали в течение 4.5 ч против 10-3 М ТРИС-буфера, буфер меняли каж-
дые 1.5 ч. В каждом эксперименте использовали свежеприготовленные липосомы, размеры (диаметры) которых варьировались в интервале 50-60 нм.
Воду очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему "МШ1^" фирмы "Миллипор" (США).
Методы исследования
Размер частиц (гидродинамический диаметр) и электрофоретическую подвижность (ЭФП) определяли методом квазиупругого светорассеяния на приборе "Brookhaven 90 Plus" фирмы "Brookhaven Instruments Company" США. Измерения проводили в термостатируемой кювете. Погрешность измерения составляла 2—5%.
Значения pH растворов находили с помощью рН-метра 210 фирмы "Hanna" (Германия). В качестве измерительного электрода использовали стеклянный электрод HI 1131B. Проводимость растворов оценивали на кондуктометре CDM 83 фирмы "Radiometer" (Дания) с платиновым электродом PP1042. Погрешность составляла 5%.
Аналитическое определение концентраций полимера в растворе проводили методом УФ-спектроскопии на спектрофотометре S-3000 (фирма "Hitachi", Япония) по характеристической полосе поглощения кватернизованного пи-ридиниего кольца [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве биодеградируемой основы мульти-липосомального контейнера использовали мицеллы триблок-сополимера ПЛА—ПЭГ—ПЛА, полученные в 10-2 М ТРИС-буферном растворе. Гидрофобное ядро мицелл представлено ПЛА-блоками, гидрофильная опушка — ПЭГ-блоками; диаметр полилактидного ядра составляет 70 ± 10 нм [19]. По данным светорассеяния гидродинамический диаметр мицелл в 10-2 М ТРИС-буферном растворе равен 160 ± 15 нм. Это позволило оценить толщину гидрофильной ПЭГ-короны: (160— 170)/2 = 45 нм. По данным микроэлектрофореза ЭФП мицелл составляла —0.6 (мкм/с)/(В/см). По-видимому, невысокий отрицательный заряд появлялся на поверхности мицелл в результате диссоциации концевых групп ОН сополимера.
В качестве липосомальных контейнеров использовали анионные липосомы ФХ/КЛ2-. Для придания липосомам аффинности к отрицательно заряженным полилактидным мицеллам на поверхности липосом был адсорбирован катионный полимер, ПЭП или полилизин. На рис. 1 представлена зависимость ЭФП липосом от концентрации добавленного ПЭП. Видно, что добавле-
m
150
ЕФИМОВА и др.
[ПЭП] X 104, моль/л
Рис. 1. Зависимость ЭФП частиц в системе ПЭП-ли-посомы от концентрации ПЭП. Липосомы ФХ/КЛ, УКЛ = 0.1; концентрация липосом 1 мг/мл; 10-2 М трис буфер; рН 7.0. Точка А соответствует концентрации ПЭП в составе комплекса ПЭП—липосома, который был использован для получения тройного комплекса с полилактидными мицеллами.
Рис. 2. Зависимость концентрации не связанного с липосомами ПЭП от его общей концентрации для комплекса ПЭП—липосомы. Липосомы ФХ/КЛ, УКЛ = 0.1; концентрация липосом 1 мг/мл; 10-2 М трис буфер; рН 7.0. Точка А соответствует концентрации ПЭП в составе комплекса ПЭП—липосома, который был использован для получения тройного комплекса с полилактидными мицеллами.
ние ПЭП вначале приводит к уменьшению ЭФП липосом до нуля, затем происходит перезарядка поверхности и, наконец, ЭФП достигает своего предельного положительного значения при концентрации ПЭП, равной 2.5 х 10-4 моль/л.
Для оценки эффективности связывания ПЭП с липосомами мы проанализировали состав су-пернатанта после отделения липосом с адсорбированным поликатионом методом УФ-спектро-фотометрии. Вид зависимости концентрации поликатиона в надосадочной жидкости от его общей концентрации в суспензии (рис. 2) свидетельствует о том, что ПЭП полностью связывается с липосомами вплоть до концентрации 2.5 х х10-4 моль/л. Эта концентрация соответствует формированию комплекса ПЭП—липосома с максимальным положительным зарядом (ср. рис. 1 и 2). При больших концентрация ПЭП начинает накапливаться в растворе.
В последующих экспериментах был использован комплекс ПЭП—липосома, полученный добавлением 1.7 х 10-4 моль/л раствора ПЭП к 1 мг/мл суспензии липосом ФХ/КЛ2-. Полученный комплекс имел положительный поверхностный заряд (точка А на рис. 1), при этом весь добавленный поликатион был связан с липосомами (точка А на рис. 2). Средний размер частиц комплекса, измеренный методом динамического све-торассения, составлял 180 нм. В дальнейшем для простоты изложения сформированный таким об-
разом комплекс ПЭП—липосома, в котором на одну липосому приходилось в среднем четыре цепи ПЭП, мы будем называть А-комплексом.
Целостность липосом в составе А-комплекса контролировали методом кондуктометрии п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.