ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 613-624
УДК 582.28.017.7
БИОГЕНЕЗ И РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЭРИТРОМИЦИНОВ
У Saccharopolyspora erythraea (Обзор)
© 2004 г. В. А. Миронов, О. В. Сергиенко, И. Н. Настасяк, В. Н. Даниленко
Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ, Москва, 109004;
e-mail: danilenk@rutenia.ru Поступила в редакцию 03.02.2004 г.
Представлены данные о структуре и этапах биосинтеза эритромицинов, связанных с последовательным присоединением сахаров L-микарозы и D-дезозамина к лактону эритронолиду B и микарозил-эритроно-лиду B соответственно и с реакциями биотрансформации эритромицина D до эритромицина A. Рассмотрены пути биосинтеза метилмалонил-КоА и пропионил-КоА - предшественников эритронолида B; биосинтез L-микарозы и D-дезозамина и свойства генов, кодирующих ферменты синтеза этих сахаров. Обсуждаются возможные механизмы генной и биохимической регуляции биосинтеза эритромицинов у Saccaharopolyspora erythraea, а также факторы, ведущие к преимущественному образованию целевого продукта - эритромицина A.
В группу эритромицинов входят макролидные антибиотики, близкие по строению и антибактериальным свойствам: эритромицины А, В, С и Б.
Впервые эритромицин А был получен из куль-туральной жидкости штамма Бтгвртотусвз вгуЛ-гвиз, выделенного из образца почв Филиппин в 1952 г., а в 1954 г. был идентифицирован эритромицин В. В настоящее время продуцент эритромицина относят к новому роду актиномицетов БаееИа-горо^рога, а наименование продуцентов эритромицинов - 8ассНагоро1узрога вгугНгава [1, 2].
Физико-химические свойства эритромицина В практически идентичны свойствам эритромицина А, однако антибактериальная активность первого на 15-20% ниже активности второго; кроме того, эритромицин В обладает почти в 2 раза большей токсичностью.
Механизм биологического действия эритромицинов обусловлен подавлением трансляции в процессе биосинтеза белков путем связывания с 50 Б-субъединицами рибосом [3, 4].
В последнее время возросло внимание к макро-лидным антибиотикам, связанное со значительными успехами в области химической и биологической трансформации их молекул. Ряд производных с 14-членным макроциклическим кольцом, в частности кларитромицин и рокситромицин, 15-членный
Список принятых сокращений: ДЕ-В - 6-деоксиэритроно-лид B; Е-В - эритронолид B; ErA - эритромицин A; ErB -эритромицин B; ErC - эритромицин C; ErD - эритромицин D; ME-B - микарозилэритронолид B; НАД(Ф)Н - никотина-амиддинуклеотид(фосфат) восстановленный; НДФ - нук-леозиддифосфат; ПКС - поликетидсинтаза; d-ТДФ - деок-си-тимидинтрифосфат; ТКЦ - трикарбоновый цикл; ффГфф - гуанозинтетрафосфат; ФР - фланкирующий регион в класторе генов; ХМФ - хлорамфеникол.
макролид с эндогенным азотом в кольце - азитро-мицин вошли в число наиболее часто применяемых в клинике препаратов при респираторных и многих других видах инфекций. Практическая ценность указанных производных стимулировала интерес к новым модификациям молекулы эритромицина [5, 6]. Большой интерес среди них вызывают новые производные, получившие обобщенное название кетолидов. Для их структуры характерно отсутствие Ь-кладинозы и наличие вместо нее С-3-кето-группы лактона. Помимо кетолидов высокой антибактериальной активностью отличаются близкие к ним ангидролиды. У ангидролидов также отсутствует Ь-кладиноза, но нет и С-3-кетогруппы (между С-2 и С-3 образуется двойная связь). Перспективными их представителями оказались аналоги 3-дезкла-динозил-2,3-ангидро-11-гидразо-6-0-метил-эритро-мицин-карбамата [5]. В последние годы исследовался терапевтический эффект созданных на основе эритромицинов препаратов в качестве антипаразитарных [7, 8], антиопухолевых [9, 10], иммуносупре-сантных [11], нейротрофических [12], антивоспалительных [13] и гастрокишечных [14].
В результате проведенных исследований структура эритромицина представляется неисчерпаемой не только для химической, но и для биологической трансформации. Последнее направление привлекает все больший интерес и, используя методы генной и метаболической (комбинаторной) инженерии и метаболической регуляции, может стать основным в биотехнологии XXI века для получения новых высоко эффективных биологически активных соединений микробиологического синтеза [15], в т.ч. и на основе антибиотиков. Именно эритромицины явились первым объектом подобных исследований, успешно развиваемых в по-
СНз
O.
6\.....»ОН
5|
СНз
НзС > 3<
Н3С о х'он
СНз Y* СНз O
Рис. 1. Химическая структура 6-деоксиэритронолида В.
следнее время [16]. На основе накопленных биохимических и генетических данных по биогенезу и регуляции биосинтеза эритромицинов методы метаболической регуляции реализуются для наиболее экономичного образования эритромицинов, в т.ч. и их новых производных [1, 16-23].
СТРУКТУРА И БИОГЕНЕЗ ЭРИТРОМИЦИНОВ
Эритромицин А (ЕгА), образуемый культурой
вгуЛгава, структурно состоит из 3 частей: 14-членного макролидного кольца (лактона) (рис. 1) и двух деоксисахаров, Б-дезозамина и Ь-кладинозы (СН3-0-3-микарозы), присоединенных к лактону (рис. 2). Условно процесс биогенеза антибиотика можно разделить на две стадии (рис. 3).
На первой стадии поликетидсинтаза (ПКС) катализирует первоначально конденсацию стартовой единицы, пропионил-КоА, с [Б]-метилмало-нил-КоА. К образующейся Р-кетоэфирной единице затем последовательно присоединяются еще 6 молекул метилмалонил-КоА. По ходу сборки поликетидной цепочки происходит декарбокси-лирование свободных карбоксильных групп метилмалонил-КоА, вследствие чего цепочка состоит только из пропионатных единиц. Каждый цикл присоединения метилмалонил-КоА завершается восстановлением возникающей кетогруппы до оксигруппы (за исключением кето-группы 3 про-пионатной единицы). Углеродный скелет 4 про-пионатной единицы подвергается полному восстановлению, осуществляемому последовательно дегидратазой, эноилредуктазой и кеторедуктазой, входящими в состав 4 модуля ПКС. Сборка поликетидной цепочки завершается ее циклизацией, катализируемой тиоэстеразой, с образованием первого свободного от связи с мультиферментным комплексом ПКС интермедиата - 6-деоксиэритронолида В (ДЕ-В). С деталями молекулярной организации и механизмом функционирования ПКС можно ознакомиться в обзорах [1-3].
На второй стадии биогенеза молекула ДЕ-В трансформируется в серии реакций с участием
O Н3С HO
R1Vl 12 НзС
он но.
НзС^СНз
£-СНзО I I
6 ........I
^О^СНз ""О........./О\^СНз
O
ОН
НзС O-R
Эритромицин R1 R2
ErA OH CH
ErB H CH
ErC OH H
ErD H H
Рис. 2. Химическая структура эритромицинов.
стереоспецифических гидроксилаз, трансфераз и метилтрансфераз.
гликозил-
Реакции гидроксилирования предшественников ErA осуществляют две цитохром Р450-зависимые монооксигеназные системы, P450eryF и P450eryK [24-27]. P450eryF, растворимый белок (45 кДа), катализирует стереоспецифическое 6-[8]-гидрокси-лирование ДЕ-В с образованием эритронолида B (E-B) [24, 25]. Далее к E-B последовательно присоединяются сахара [28-30]: сначала L-микароза с образованием 3-а-микарозилэритронолида В (МЕ-В), а затем, к МЕ-В, D-дезозамина с образованием эритромицина D (ErD).
ErD может превращаться в ErA двумя альтернативными путями (рис. 3). В одном из них происходит сначала 0-метилирование при С-3 микаро-зы в ErD с образованием эритромицина В (ErB), который затем гидроксилируется (при С-12 лак-тона) до ErA. Другой путь: сначала происходит ги-дроксилирование ErD до эритромицина С (ErC), а затем метилирование последнего. Обе реакции метилирования катализирует один фермент-0-ме-тилтрансфераза, кодируемая геном eryG [14, 31]. Относительная активность фермента в 2 раза выше с ErC, чем с ErD. Реакции гидроксилирования осуществляются белком EryK (44 кДа) [26, 27]. Каталитическая активность EryK с субстратом ErD в 1200-1900 раз превышает таковую eryG с субстратом ErD [10]. Эти данные служат аргументом в пользу того, что основным путем образования ErA из ErD является путь через ErC [27].
3
3
Пропионил-КоА -»- -+
Метилмалонил-КоА А
EryA (ПКС) 6-Деоксиэритронолид В
EryF Эритронолид В
; Субстраты
i
Глюкозо-1-Ф
EryB
—----Микароза -
3-а-Микарозилэритронолид В
EryC ___Дезозамин
Эритромицин D
EryG ЭритромиЦин B
EryK
EryK
Эритромицин C
EryG
Пропионат "" (2)
_Пропионил-КоА
-Пропанол Триацилглицерин
(1) \(12)
(4)
Ацил-КоА
(5)
ОУК
Углеводы !(Ю)
i
ФЕП
Пируват
(3)
[RJ-метилмалонил-КоА
(8)
J
Ацетил-КоА
♦
(11)
[SJ-метилмалонил-КоА чХ^ а-Кетоглутарат
(9)
ДЕ-В
Сукцинил-КоА
Эритромицин А
Рис. 3. Схема биосинтеза эритромицинов. Обозначения: ЕгуА, Г, В, С, О, К - белки (ферменты), кодируемые генами егуА, Г, В, С, О, К соответственно.
БИОСИНТЕЗ 6-ДЕОКСИЭРИТРОНОЛИДА В (ДЕ-В)
Основными C-содержащими субстратами, используемыми в составе питательных сред, применяемых для культивирования продуцента эритромицинов S. erythraea, являются углеводы (крахмал и декстрин; в меньшей степени глюкоза и сахароза) и растительные масла (соевое, рапсовое и в меньшей степени некоторые другие) [32-35]. В качестве предшественника пропионил-КоА часто используют н-пропанол [36-37], однако стимулирующий эффект спирта на биосинтез эритромицинов у некоторых штаммов S. erythraea не проявляется [38-39].
Основными путями образования пропионил-КоА являются: в случае утилизации углеводов катаболизм их через гликолиз и трикарбоновый цикл (ТКЦ) до стадии синтеза сукцинил-КоА из а-кетоглутаровой кислоты; в случае утилизации масел - липолиз триациаглицерина (основного компонента масел) до свободных жирных кислот и(или) ацил-КоА с последующим вовлечением последних в ТКЦ (рис. 4).
Скорость окисления интермедиатов на стадии ТКЦ (от пировиноградной кислоты до сукцинил-КоА) прямо коррелирует с интенсивностью био-
Рис. 4. Схема биосинтеза 6-деоксиэритронолида В (ДЕ-В). Обозначения: ФЕП - фосфоэнолпируват; ОУК - оксалоуксусная кислота; 1 - алкогольдегидро-геназа; 2 - пропионаткиназа; 3 - р-окисление жирных кислот; 4 - пропионил-КоА 1-карбоксилаза; 5 - мало-нилдекарбоксилаза; 6 - карбоксилтрансфераза; 7 -мутаза; 8 - эпимераза; 9 - поликетидсинтаза; 10 - гликолиз; 11
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.