ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 306-311
УДК 581.14
БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МОРФОГЕИЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ in vitro
© 2007 г. Н. В. Евсеева*, О. В. Ткаченко**, Ю. В. Лобачев**, И. Ю. Фадеева*, С. Ю. Щеголев*
* Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов ** Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова", Саратов
Поступила в редакцию 30.05.2006 г.
Исследованы морфогенетические процессы в незрелых зародышах пшеницы (Triticum aestivum L.) c использованием молекулярного маркера меристематических клеток злаковых культур - проли-феративного антигена инициалей (ПАИ). Использована генетическая модель, включающая набор почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по аллелям генов короткостебельности RhtB1c, RhtB1b и Rht14 и исходный сорт Саратовская 29. Установлено влияние генетической системы Rht на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы в процессе каллусообразования и последующей регенерации. Выявлены различия в содержании ПАИ на определенных этапах культивирования и общая закономерность его динамики в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в кал-лусной ткани. Обсуждается возможная функция ПАИ в качестве маркера клеток меристематических очагов в каллусной ткани и перспектива его использования в селекционных программах в качестве дополнительного критерия оценки морфогенетической способности вновь получаемых линий пшеницы.
Triticum aestivum - пролиферативный антиген инициалей -Rht-гены - почти изогенные линии - антитела
ВВЕДЕНИЕ
Одним из важнейших вопросов культивирования растительных объектов является сохранение растительными клетками морфогенетического потенциала. Тотипотентность таких клеток зависит, в основном, от исходного генотипа и условий их культивирования. В последние годы для идентификации генов, контролирующих морфогенез in vitro, используют ДНК-маркеры [1-3]. Многие исследователи отмечают, что формирование организованных структур(почек, корней, эмбриои-дов) in vitro коррелирует с изменением в синтезе мРНК и белков [4-7], а также с активностью ферментов [8, 9].
Несмотря на большое количество исследований по эмбриогенезу растений in vitro, многие вопросы этого уникального пути развития остаются нерешенными. В частности, малочисленны сведе-
Сокращения: АТ - антитела, ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор, ПАИ - пролиферативный антиген инициалей.
Адрес для корреспонденции: Евсеева Нина Васильевна. 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов. Электронная почта: nina@ibppm.sgu.ru
ния о влиянии индивидуальных генов на проявление тотипотентности клеток in vitro на объектах с трудной регенерацией, к которым относятся злаки.
В связи с этим актуальной задачей является выявление роли конкретных генетических систем и генов, влияющих на способность растительных эксплантов к культивированию, а также идентификация новых белковых маркеров, отражающих морфогенетический потенциал каллусных клеток растений in vitro. Для решения этих вопросов необходимо создание экспериментальных генетических моделей, включающих в себя изогенные линии, где в идеальном варианте известна функциональная связь между экспрессией гена, кодируемого им белка и его фенотипиче-ским проявлением [10].
В наших предыдущих исследованиях было показано, что пролиферативный антиген инициалей (ПАИ) является молекулярным маркером меристематических клеток пшеницы [11, 12]. Установлено, что содержание этого антигена в апексах стеблей различных типов пшениц коррелирует с функциональной активностью меристематических клеток, которая детерминирована определенным состоянием их генов [13]. На генетической модели, включающей высокорослый сорт мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и
его почти изогенные линии, альтернативные по гену КЬБ1с, была также выявлена связь между морфогенетическим потенциалом каллусных клеток и содержанием ПАИ [14]. В экспериментах с неморфогенными каллусами различного происхождения (от короткостебельных или высокорослых линий) при иммунодиффузионном анализе мы не обнаружили ПАИ [14]. При этом в морфогенных каллусах этих же линий пшеницы ПАИ выявлялся достаточно четко. Это позволило сделать вывод о том, что ПАИ связан с закладкой меристематических очагов в каллусной ткани и может считаться маркером морфогенеза.
Целью данной работы явилось исследование морфогенетического потенциала соматических каллусов набора почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по Rht-генам, и установление общей закономерности динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации.
МЕТОДИКА
Исследуемая генетическая модель включала сорт высокорослой яровой пшеницы (ТгШсит aestivum L.) Саратовская 29 и набор его почти изогенных линий, включающий короткостебельные линии, несущие аллели КЫВ1с, Rht14, RhtB1b, а также их соответствующие высокорослые сибы, несущие аллели Л2RhtB1a, гЫ14, ЛШЫВ1а. Таким образом, было исследовано 7 генотипов пшеницы. Изогенные линии были получены Лобачевым методом возвратных скрещиваний [15, с. 44-46]. Сестринские почти изогенные линии были на 99.2% идентичны сорту-реципиенту Саратовская 29.
В течение двух лет (2004-2005 гг.) в полевых условиях выращивали донорные растения исследованных генотипов. Незрелые (14-дневные) зародыши пшеницы для индукции каллусогенеза культивировали в течение 30 суток на среде Линс-майера-Скуга (с 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты). Регенерацию полученных морфогенных каллусов проводили на среде Блейдза (с 0.5 мг/л ИУК и 0.5 мг/л кинетина). На питательную среду для каллусогенеза сажали по 40 зародышей каждого варианта (по 1 зародышу в пробирку). В течение 30 суток каллусы культивировали на среде для каллусогенеза, а затем только морфогенные каллусы пересаживали на среду для регенерации. Морфогенетическую реакцию каллусов определяли только на 30-е сутки по общепринятой методике [16, 17].
Сравнительную оценку содержания ПАИ в растительных экстрактах проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа в полистироловых планшетах ("Медполимер", Санкт-Петербург). Для этого отбирали в трех повторностях по 3 каллуса от каждого генотипа в момент закладки
опыта (незрелый зародыш) и на 7-, 14-, 24-, 30-е сутки на среде для каллусогенеза, а также на 32- и 39-е сутки на среде для регенерации. Суммарную водорастворимую фракцию белков из каллусной ткани пшеницы получали путем разрушения каллуса в фарфоровой ступке и экстракции в буфере следующего состава: 50 мМ Трис-НС1, рН 7.8, 0.02 М в-меркаптоэтанол, 0.001 М фенилметил-сульфонилфлюорид. Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1 : 5. Гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. Полученный супернатант использовали для им-муноферментного анализа.
Суммарную фракцию каллусных белков каждой пробы титровали в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) (0.02 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.0, до 6-й лунки, по 50 мкл в каждой). Затем сенсибилизировали при комнатной температуре на шейкере и оставляли на ночь при 4°С. Для удаления несвязавшихся с полистиролом молекул белка лунки однократно промывали ЗФР, содержащим 0.02% Tween 20. В промытые лунки добавляли по 0.1 мл 0.05% ПЭГ (Мг = 20000) для предотвращения связывания антител (Ат) с твердым носителем. Планшеты выдерживали на шейкере 1 ч при температуре 22°С. После этого в каждую лунку добавляли по 0.05 мл кроличьих моноспецифических Ат к ПАИ, разведенных в ЗФР (1 : 200) с добавлением 0.05% ПЭГ (1 : 10) и 0.02% Tween 20 и инкубировали при 37°С 1 ч. После трехкратной промывки в ЗФР с добавлением 0.02% Tween 20 в лунки планшета добавляли антикроличьи Ат, меченные пероксидазой, и инкубировали на шейкере при комнатной температуре 1 ч. После трехкратной промывки в лунки добавляли цитратный буфер (рН 4.5), содержащий ортофенилендиамин (0.03%) и Н202 (0.1%), для оценки пероксидазной активности. Развитие окраски останавливали добавлением 1 N Н^04. Интенсивность хромофорного ответа определяли на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С при длине волны света 490 нм. Тестировали материал по значению оптической плотности в 3-й лунке. Для учета неспецифической окраски с субстратом были использованы контрольные лунки, где в первом случае вместо Ат к ПАИ была добавлена сыворотка неиммунизированного кролика, во втором случае отсутствовали Ат к ПАИ, а в третьем - отсутствовали как Ат к ПАИ, так и антикроличьи Ат, меченные пероксидазой.
Статистическую обработку результатов проводили однофакторным дисперсионным анализом с определением наименьшей существенной разницы (НСР0.5) [18]. Эффект гена в (%) определяли путем сопоставления средних значений изучаемого признака у короткостебельной линии, ее высокорослого сиба и исходного сорта Саратов-
0.9
0.8
и
о
£ 0.7
о
£
о 0.6 9
^ к
&°.5 л
В
о к н о ч
к
«
се
м о о V к н к О
0.4
0.3
0.2
0.1
(а)
60
50
св
О ^
1=40
а
м
о и О
к30
о и о
■е &
о
^20 и о й
РР
(б)
10
14
24
30
32
39
Время культивирования, сутки
Вариант
Рис. 1. Динамика содержания ПАИ (а) и выход морфогенных каллусов (б) в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации у пшеницы сорта Саратовская 29 (1), его низкорослой линии с геном RhtB1c (ЛХЫШс, 2) и ее высокорослого сиба с геном RhtB1a (Л2RhtB1a, 3). Кривая на (а) - линия тренда У. НСР05 = 0.053 (а) и 8.12 (б).
0
0
0
7
ская 29 только в случае их достоверных различий [15, с. 47].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный иммунохимический анализ содержания ПАИ в незрелых зародышах и каллу-сной ткани пшеницы в процессе каллусогенеза и последующей регенерации показал, что в незрелых зародышах (до начала культивирования) всех семи изученных генотипов содержание ПАИ было одинаковым (рис. 1а, 2а, 3а). Возможно, этот факт объясняется функционированием инициальных клеток в эмбриональных апексах незрелых зародышей пшеницы. В процессе каллусогенеза проводили сравнительный анализ с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.