НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 2, с. 110-114
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ АПОПТОЗА В МОЗГЕ "ИНТАКТНЫХ" КРЫС И ПРИ ЦЕНТРАЛЬНОМ ДЕЙСТВИИ БЕЛКА 8100Ь
© 2004 г. В. В. Шерстнев*, В. В. Юрасов, М. А. Грудень, Н. Е. Яковлева, 3. И. Сторожева, А. Т. Прошин, А. В. Пузырев
ГУ НИИ нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН, Москва
Исследовали активность каспазы-3 и межнуклеосомальную фрагментацию ДНК в мозжечке, гип-покампе и префронтальной коре мозга "интактных" половозрелых крыс, а также животных через 4, 10, 24 и 48 ч после аппликации на червь мозжечка белка 8100Ъ в дозе, вызывающей апоптоз клеток нервной ткани и нарушения долговременной памяти. Показано, что в мозге "интактных" животных присутствует "фоновая" активность исследованных биохимических маркеров апоптоза. При этом уровень активности каспазы-3 и выраженность фрагментации ДНК по "лестничному" типу различны в отдельных мозговых структурах. Аппликация 8100Ъ инициирует гетерогенные и ге-терохронные изменения биохимических маркеров в изученных структурах мозга. Полученные данные рассматриваются как экспериментальное свидетельство участия процессов и молекулярных факторов запрограммированной гибели клеток в механизмах интегративной деятельности нервной системы.
Ключевые слова: апоптоз, каспаза-3, фрагментация ДНК, белок Б100Ь, мозг.
ВВЕДЕНИЕ
Постоянно возрастающий интерес многих специалистов - нейробиологов, наряду с проблемой нейрогенеза в "зрелом" мозге, вызывают исследования процессов программированной гибели (апоптоза) клеток в нервной системе. В настоящее время основное внимание направлено на изучение апоптоза в развивающемся мозге, а также при различных нарушениях его функций при нервно-психических заболеваниях. Вместе с тем сравнительно немногочисленны и противоречивы экспериментальные данные об апоптотичес-кой гибели клеток в зрелом мозге человека и животных в условиях нормы, которые в значительной части получены в опытах in vitro [1-4].
Не ослабевает интерес к изучению функционального значения и механизмов действия широко известных белков группы S100 и, особенно, нейроспецифического белка S100b, который тесно сопряжен как с процессами интегративной деятельности мозга и нейрона, так и c развитием заболеваний нервной системы. Интенсивно разрабатываются аспекты возможного практического применения S100b с целью диагностики и лечения. В последние годы биологическая активность белка S100b на молекулярном уровне рассматривается с позиции его непосредственного участия в
*Адресат для корреспонденции: 125009 Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4; e-mail: niinf@aha.ru; тел.: 292-5337.
регуляции развития и апоптоза нервных и глиаль-ных клеток [5-7].
Учитывая изложенное, в настоящей работе исследовали биохимические маркеры апоптоза: активность каспазы-3 и межнуклеосомальную фрагментацию ДНК в структурах мозга "интактных" половозрелых крыс, а также динамику и выраженность указанных показателей у животных в условиях аппликации на червь мозжечка белка S100b в дозе, вызывающей нарушения долговременной памяти и активацию апоптоза в нервной ткани in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Wistar 3-месячного возраста и массой 200-220 г. Животным апплицировали белок S100b в дозе 500 нг на кору червя мозжечка в 3 мкл физиологического раствора. В качестве контроля использовали интактных животных и крыс, которым на червь мозжечка апплицировали физиологический раствор. Спустя 4, 10, 24 и 48 ч после введения выделяли мозжечок, гиппо-камп и префронтальную кору мозга. Число животных в каждой группе 8.
Структуры головного мозга крыс выделяли при +4°С и гомогенизировали в охлажденном ли-зирующем буфере (pH 8.0) (150 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0.5% дезоксихолат натрия, 50 мМ Трис, 5 мМ дитиотриетол, 2 мМ ЭДТА) в соотношении
ткань-буфер 1 : 20 (=10 мг белка на 1 мл суперна-танта) на гомогенизаторе Heidolph DIAX 100 (Германия) при 5000 об/мин в течение 15 с. Гомо-генат центрифугировали при 10000 х g в течение 15 мин на центрифуге Sorval 5B (Du Pont, USA) [8]. Супернатант использовали для определения концентрации белка биуретовым методом, активности каспазы-3 и выделения ДНК.
Активность каспазы-3 выявляли, инкубируя аликвоты супернатанта (=300 мкг белка) в присутствии 200 мкМ субстрата каспазы-3 ацетил-асп-глу-вал-асп-р-нитроанилида (Ac-DEVD-p-ni-troanilide) (A-2559, Sigma, USA) в объеме 500 мкл при +37°С. Состав буфера для инкубации: включал 20 мМ HEPES (pH 7.5), 5 мМ дитиотриетол, 2 мМ ЭДТА [9]. Высвобождение в реакционную среду р-нитроанилина оценивали через 30 мин спектрофотометрически на спектрофотометре DU-70 (Beckman, USA) при 405 нм. Активность каспазы-3 рассчитывали по скорости высвобождения р-нитроанилина в фмоль/мин на 1 мг белка и выражали в процентах, принимая за 100% активность фермента у контрольных животных. Для подтверждения специфичности гидролиза ацетил-асп-глу-вал-асп-р-нитроанилида каспазой-3 опытные пробы дополнительно инкубировали в присутствии 20 мкМ ингибитора каспазы-3 Ac-DEVD-CHO (A-0835, Sigma, USA). В качестве отрицательных "холостых проб" отдельно инкубировали субстрат каспазы и аликвоты суперна-тантов без добавления каспазного субстрата.
Межнуклеосомальную фрагментацию ДНК выявляли методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с прокрашиванием ДНК бромистым этидием [10]. После отбора аликвот для определения активности каспазы-3, часть супернатанта инкубировали в присутствии 1%-ного раствора додецилсульфата натрия и 5 мкг/мкл РНКазы в течение 1 ч при +56°С. Последующий гидролиз белков проводили в присутствии 2.5 мкг/мкл протеиназы К (Sigma, USA) в течение 5 ч, +37°С. ДНК осаждали последовательным добавлением к пробе 10 М ацетата аммония (0.5 объема) и 96% этилового спирта (2.5 объема) в течение 16 ч, -20°С. Пробы центрифугировали при 15000 х g на центрифуге Sorval 5B (Du Pont, USA) в течение 20 мин, осадок дважды промывали 10 объемами этилового спирта, переосаждали при -70°С и центрифугировали при 3500 х g в течение 10 мин. Супернатант сливали, осажденную ДНК лиофили-зировали и перерастворяли в ТЭ-буфере pH 7.4 (10 мМ Трис и 0.1 мМ ЭДТА). Концентрацию ДНК (0.25-2.5 мг/мл) в пробах определяли спект-рофотометрически при 260 нм и корректировали загрязненность препарата олигопептидами по соотношению оптических плотностей при 260 нм и 280 нм [11]. Далее ДНК пробы смешивали с загрузочным буфером (TBE х 1, 0.05% бромфеноло-вый синий, 28% сахарозы) в соотношении 4 : 1 по
объему и вносили в лунки агарозного геля в объеме 5 мкл (50-500 нг ДНК). Электрофорез фрагментов ДНК проводили в камере SE-2 производства "Хеликон" (Россия) в 2%-ном агарозном геле, в который предварительно добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Электрофорез проводили в буфере TBE (90 мМ Трис и 2.5 мМ ЭДТА, 90 мМ борная кислота, pH 8.2), при напряжении 200 В и +4°С в течение 50 мин. Гель подсушивали на установке Slab Gel Dryer (LKB, Швеция). Фрагментацию ДНК выявляли в УФ-свете с последующим электронным документированием видеоизображений. В качестве стандарта - маркера ДНК использовали коммерческий препарат (D-5042, Sigma, USA) с фрагментами от 123 пар оснований (п.о.) до 4182 п.о. и инкрементом в 123 п.о.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Активность каспазы-3 у "интактных" животных в исследованных структурах мозга - мозжечке, гиппокампе и префронтальной коре - выявлялась в следующих диапазонах: 4-10, 5-15 и 2-7 фмоль/мин/1 мг белка соответственно. Интересно, что индивидуальные регионарные различия активности каспазы-3 были более четко выражены. Так,одно из животных в группе интактных крыс демонстрировало следующие показатели ферментативной активности: 9.4, 14.3, 2.2 фмоль/мин/1 мг белка.
Белок S100b при аппликации на червь мозжечка не вызывал достоверных изменений активности каспазы-3 в мозжечке по сравнению с интакт-ными животными на всех временных этапах ее определения, так же как в префронтальной коре и гиппокампе через 4 и 10 ч после введения белка. Вместе с тем следует отметить, что через 4 ч активность каспазы-3 в исследованных структурах имела тенденцию к снижению на 20-30%. Спустя 24 ч активность фермента в префронтальной коре повышалась на 250%, сохраняясь на том же уровне и через 48 ч. При этом в гиппокампе выявлялось самое выраженное (до 10-15 раз) увеличение активности каспазы-3 резко снижавшееся к 48 ч, но оставаясь на 100% выше, чем у интактных крыс (табл. 1).
При изучении фрагментации ДНК не было выявлено значимых различий в интенсивности данного процесса у крыс, которым апплицировали на червь мозжечка физиологический раствор, и "интактных" животных. Однако следует отметить, что у тех и других крыс возможно четко документировать межнуклеосомальную фрагментацию ДНК по "лестничному" типу, характерную для аппоптоза. В группе экспериментальных живот-
НЕЙРОХИМИЯ том 21 < 2 2004
112
ШЕРСТНЕВ и др.
Таблица 1. Активность каспазы-3 в мозжечке, гиппо-кампе и префронтальной коре крыс через 4, 10, 24 и 48 ч после аппликации 8100Ъ на червь мозжечка (высвобождение р-нитроанилина в фмоль/мин/мг белка, в процентах относительно активности фермента у ин-тактных животных, принятого за 100%; М ± 8.Е.М)
Группа Структура мозга
мозжечок гиппокамп кора
Интактные 100 ± 14 100 ± 23 100 ± 12
животные
4 ч 63 ± 27 60 ± 21 79 ± 18
10 ч 107 ± 28 80 ± 19 113 ± 17
24 ч 104 ± 31 1250 ± 146* 334 ± 49*
48 ч 102 ± 26 220 ± 38* 367±53*
* - Отличия от интактных животных достоверны прир < 0.05.
ных, получавших белок 8100Ъ, регистрировали фрагментацию ДНК по "лестничному" типу, выраженность и динамика которой были различны в изученных структурах мозга.
Так, в мозжечке интенсивность процесса меж-нуклеосомальной фрагментации ДНК прогрессивно снижалась во времени, и спустя 24-48 ч после аппликации 8100Ъ фрагменты ДНК не выявлялись. В префронтальной коре через 4 ч регистрировали выраженную фрагментацию ДНК в пределах от 900 до 180 пар оснований, спустя 10 ч вы-
являли лишь самые короткие фрагменты: 180 и 3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.