БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2005, том 31. № 2, с. 130-139
УДК 577.112:6/5.787
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНАЛОГОВ ХОЛЕЦИСТОКИНИН-(30-33)-ТЕТРАПЕПТИДА
© 2005 г. Т. В. Проскурякова*", Ж. Д. Беспалова**, М. Е. Палькеева**, О. Б. Петриченко*, Н. В. Панкратова*, В. А. Шохонова*, И. П. Анохина*
* ГУ Национальный научный центр наркологии МЗ РФ, 119002, Москва, ГСП-2, М. Могильцевский пер., 3; **Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва Поступила в редакцию 05.01.2004 г. Принята к печати 22.10.2004 г.
Синтезированы аналоги эндогенного тетрапептида - (ЗО-ЗЗ)-фрагмента холецистокинина (Тгр-Меь А8р-РЬе-ЫН2) и исследована их биологическая активность. Показано, что сукцинилирование /У-кон-цевого триптофана в №е2-аналоге тетрапептида приводило к усилению его анксиогенных свойств у крыс в тесте "светлая-темная" камера и способности увеличивать потребление алкоголя как контрольными, так и длительно алкоголизированными крысами в условиях свободного выбора. Введение в С-концевую амидную группировку №е2-аналога тетрапептида пространственного изопро-пильного заместителя приводило к появлению анксиолитической и антиалкогольной активности, а также способности повышать анальгетический эффект морфина в тесте отдергивания хвоста у крыс. При этом оба синтезированных аналога сохраняли сродство к холецистокининовым рецепторам.
Ключевые слова: холецистокинин, (ЗО-ЗЗ)-фрагмент (ССК-4), синтез аналогов, биологическая активность.
ВВЕДЕНИЕ
Функциональная роль холецистокинина (сЬо1е-сувюкиип, ССК), особенно в центральной нервной системе (ЦНС), до конца не выяснена. Однако уже сегодня можно констатировать, что ССК-си-стема вовлечена в регуляцию насыщения [1], гас-троинтестинальных реакций [2], иммунологических реакций [3], двигательной активности [4], памяти [5], обучения [6], болевой чувствительности [7] и тревожных состояний [8, 9]. Один из механизмов, посредством которого ССК-система участвует в регуляции перечисленных выше физиологических процессов, связан с инициированием ССК-пептидами образования сложных регуля-торных цепей [10].
В организме ССК синтезируется в тканях поджелудочной железы и мозга. Под действием про-теолитических ферментов ССК расщепляется на ряд биологически активных фрагментов (ССК-пептидов), из которых наиболее изученными являются октапептидный (ССК-8) и тетрапептид-ный (ССК-4) фрагменты [11]. Установлено, что
Использованы стандартные сокращения, рекомендованные комиссией IUPAC-IUB, а также: ССК - холецистокинин; EGTA - (этилендиокси)днэтилендинитролотетраук-сусная кислота; HEPES - Д'-(2-гидроксиэтнл)пипера'л[н-Д''-2-этансульфоновая кислота; ONSu - сукциннмид-Л/-окси-; Suc - сукцинил.
#Автор для переписки (тел.; (095) 241-02-43; эл. почта: pro.s-lab@mtu-net.ru).
90% ССК-пептидов в ЦНС представлено ССК-8, сульфатированным по тирозину в положении 7 (ССК-8(8)) [12, 13]. Действие биологически активных ССК-пептидов опосредуется двумя типами рецепторов (ССК-1 и ССК-2), локализованных как в периферических тканях, так и в ЦНС [14]. Считается доказанным, что ССК-8(8) обладает практически одинаковым сродством к ССК-1- и к ССК-2-рецепторам, тогда как ССК-4 проявляет выраженную селективность к ССК-2-рецепторам [15].
Способность ССК-пептидов модулировать функционирование различных нейромедиаторных систем, а также положительный клинический опыт применения некоторых из них для купирования состояния тревоги [16, 17] инициировали серию исследований по разработке новых соединений, обладающих сродством к ССК-рецепторам. При этом в качестве основы для создания новых лигандов ССК-рецепторов берутся соединения различной химической природы [18-21]. На наш взгляд, наибольшего внимания заслуживают исследования, в которых новые лиганды ССК-рецепторов разрабатываются на основе эндогенных ССК-пептидов [22-25].
При разработке структурных модификаций ССК-пептидов на первое место выступает требование сохранения у вновь созданных пептидов сродства к ССК-рецепторам при выраженной селективности к одному из двух типов ССК-рецепто-ров, что позволяет уменьшать неспецифическую
Tip
Nle
Вое —ONp К-Вос
H+ONp
Z-
Z -Z -
H
Asp Phe
Z— ONp
NH3/MeOH (NH2-CH(CH3)2)
Z--NH, (I) (-NH-CH(CH3)2)
H2/Pd
OBu'
— ONp H-^NH2 OBu'
H2/Pd OBu'
,OBu'
H2/Pd /OBu'
OBu'
-NH,(II)
-NH2 (III) —NH2 (IV)
TFA
-NH2 (V)
-NH2 (VI) (-NH-CH(CH3)2)
H-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 (VII) H-Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH3)2 (IX) (CH2C0)20
HOOC(CH2)COO-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 (VIII)
Схема.
токсичность. При решении этой задачи приоритетным является анализ связи структура-активность, проведение которого для больших молекул сложно. Поэтому при разработке новых структур большинство исследователей берет за основу минимальный биологически активный фрагмент ССК-ССК-4 (Тгр-Ме1-А8р-РЬе->Ш2) с выраженной селективностью к ССК-2-рецепторам [15].
В связи с этим, цель настоящей работы состояла в синтезе аналогов пептида ССК-4 и изучении их биологической активности в экспериментальных моделях на животных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показано, что изменение конформации практически всех пептидных связей ССК-4 оказывает влияние как на сродство, так и на селективность аналогов к ССК-рецепторам [26-28]. При этом выявлены структурные модификации, позволяю-
щие создавать аналоги, обладающие выраженной селективностью к ССК-1-рецепторам [29]. Кроме того, продемонстрирована возможность при одновременной модификации N- и С-терминальных участков ССК-4 формировать у новых соединений свойства, характерные как для агонистов, так и для антагонистов ССК-рецепторов [24, 25].
На основании данных компьютерного конфор-мационного анализа ССК-4, проведенного нами с помощью коммерческой программы "Modeller", был разработан ряд структурных модификаций и осуществлен синтез двух его аналогов: Suc-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 CVIII) и Trp-N le-Asp-PheNHCH(CH3)2 (IX) (схема).
Синтез обоих пептидов осуществляли классическим методом в растворе путем последовательного наращивания пептидной цепи, начиная с соответствующей С-концевой аминокислоты, с использованием активированных эфиров Z- и Вос-защищен-
Таблица 1. Химические сдвиги 8 (м. д.) амидных и алифатических протонов в пептидных аналогах ССК-4
Остаток в пептиде NH CaH CPH Другие сигналы
Suc-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 (VIII)
Trpl 8.11 4.52 3.11; 2.94 -
Nle2 7.93 4.16 1.47; 1.57 -
Asp3 8.13 4.49 2.65; 2.49 -
Phe4 7.79 4.36 3.03; 2.84 Sue: CH2 3.35
Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH3)2 (IX)
Trpl - 3.92 3.19; 2.96 -
Nle2 8.58 4.26 1.63; 1.50 -
Asp3 8.40 4.49 2.45; 2.63 -
Phe4 7.80 4.36 2.94; 2.83 -NH-CH(CH3)2 : NH 7.60; CH 3.37; CH3 1.02; 0.92
ных аминокислот. Боковая карбоксильная функция аспарагиновой кислоты защищалась трет-бутиль-ной группой. Деблокирование Вое-, Ви'-защищен-ного тетрапептида в обоих случаях проводили действием ТБА с 5% воды и 5% этандитиола. Идентификацию целевых продуктов (VIII), (IX) выполняли методами количественного аминокислотного анализа и спектроскопии 'Н-ЯМР, гомогенность подтверждали методами ТСХ и аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе. Данные
ЯМР-спектроскопии синтезированных соединений приведены в табл. 1, физико-химические характеристики - в табл. 2.
Для того чтобы выяснить, сохранили ли аналоги (VIII) и (IX) сродство к ССК-рецепторам, в первую очередь, была проведена оценка их действия на связывание [125I]-CCK-8(S) с мембранными препаратами коры больших полушарий головного мозга (cortex), где преимущественно локализованы CCK-2-рецепторы, и препаратами поджелудочной железы (pancreas), где локализованы ССК-1 -рецепторы. При добавлении в реакционную среду оба аналога ССК-4 вызывали дозозависимое ингиби-рование связывания [l25I]-CCK-8(S) со специфическими участками (рис. 1), константы ингибиро-вания связывания указаны в табл. 3.
Представленные данные свидетельствуют, что оба аналога ССК-4 сохранили сродство к ССК-ре-цепторам, но при этом аналог (УШ) демонстрирует более выраженную избирательность к CCK-2-pe-цепторам, а аналог (IX) - к ССК-1-рецепторам.
При сравнении сродства синтезированных аналогов ССК-4 с аффинностью эндогенного тетрапептида ССК [26,30] удалось выявить следующее. Сукщшилирование /V-концевого Тгр в норлейцино-вом аналоге ССК-4 в 2 раза увеличивает сродство аналога (УШ) к ССК-1-рецепторам (К, 4770 против 11900 нМ), тогда как аффинность к CCK-2-рецеп-торам не меняется (Kt 34 против 42 нМ). В то же время введение в С-концевой амид изопропильно-го радикала -СН(СН3)2 у аналога (IX) еще более
Таблица 2. Характеристики синтезированных соединений
Соединение Rf в системах R* , мин Т. пл., °С Выход, % от теор.
A Б В Г д Е
Z-Phe-NH2 (I) 0.59 0.34 165-167 67
Z-Asp(OBu'bPhe-NH2 (II) 0.52 0.63 163-164 69
H-Asp(OBu')-Phe-NH2 (III) 0.24 117-119 77
Z-Nle-Asp(OBu')-Phe-NH2 (IV) 0.54 0.37 171-172 97
H-N le-Asp(OBu')-Phe-NH2 (V) 0.19 0.39 - 83
Boc-Trp-Nle-Asp(OBu')-Phe-NH2 (VI) 0.51 0.61 179-181 79
H-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 (VII) 0.25 20.6 125-127 73
Suc-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 (VIII) 0.56 22.4 121-123 82
Z-Phe-NH-CH(CH3)2 0.86 0.94 154-155 97
Z-Asp(OBu')-Phe-NH-CH(CH3)2 0.89 0.5 159-160 98
Z-Nle-Asp(OBu')-Phe-NH-CH(CH3)2 0.59 0.88 192-193 77
Boc-Trp-Nle-Asp(OBuf)-Phe-NH-CH(CH3)2 0.34 0.57 218-221 72
H-Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH3)2 (IX) 0.28 0.55 19.5 132-137 24 (в расчете
на исх.
Z-Phe-ONp)
* Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили как описано в "Эксперимент, части" в условиях 30-минутной градиентной элюции от 20 до 80% буфера Б в буфере А: для соединений (VII) и (IX) - буфер А - 0.1% водная TFA, буфер Б - 80% ацетонитрнла в буфере А; для соединения (VIH) - буфер А - 0.05 М КН2Р04, рН 3.0, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А.
О1 1 1 1
_1_I_i_I_I_I_I_L_
9 8 7 6 5 4 3 -^[аналог (VIII)]
В 7 6 5 4 3 -^[аналог (IX)]
Рис. 1. Специфическое связывание [1251]-ССК-8(5) мембранными препаратами коры больших полушарий головного мозга (Л и поджелудочной железы (2) в присутствии аналогов (VIII) и (IX).
увеличивает его сродство к ССК-1-рецепторам (Кi 234 нМ), уменьшая при этом на два порядка его способность взаимодействоват
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.