ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 443, № 1, с. 123-126
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ IN VITRO И IN VIVO ПЕПТИДОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТРЕТЬЕЙ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ПЕТЛЕ
РЕЦЕПТОРА ТИРЕОТРОПИНА
© 2012 г. Е. А. Шпакова, А. О. Шпаков, О. В. Чистякова, И. В. Мойсеюк, К. В. Деркач
Представлено академиком В.Л. Свидерским 17.10.2011 г. Поступило 17.10.2011 г.
В последние годы одним из интенсивно развивающихся направлений молекулярной эндокринологии и нанобиотехнологии является пептидная стратегия, которая стала широко применяться для изучения молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов в клетку и создания высокоселективных и высокоэффективных регуляторов гормональных сигнальных систем [1, 2]. В ее основе лежит поиск и разработка пептидов, соответствующих по структуре функционально важным участкам сигнальных белков — рецепторов, гетеротримерных О-белков и ферментов, генерирующих вторичные посредники. Наиболее перспективным направлением пептидной стратегии является синтез и изучение пептидов, производных рецепторов серпантинного типа, поскольку на их уровне осуществляется не только специфическое опознавание внешнего сигнала, но и происходит выбор пути его передачи в клетку, а следовательно, определяются внутриклеточные мишени действия гормона. Нами и другими авторами показано, что пептиды, соответствующие цитоплазматическим петлям (ЦП) рецепторов серпантинного типа, селективно взаимодействуют с О-белками, запускают сигнальные каскады в отсутствие гормона, влияют на передачу генерируемого им сигнала через гомологичный рецептор, таким образом действуя как внутриклеточные регуляторы сигнальной трансдукции [3—9].
Одной из актуальных задач современной эндокринологии является поиск эффективных регуляторов функций щитовидной железы и всей гипота-ламо-гипофизарно-тиреоидной оси, действующих на этапе активации гормоном рецептора тирео-тропного гормона (ТТГ). Нарушения, возникающие на этом этапе сигнальной трансдукции, приводят к широкому спектру заболеваний щитовидной железы, в том числе к аутоиммунному тиреоидиту
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
и раку щитовидной железы. Цель исследования состояла в разработке селективных регуляторов контролируемых ТТГ сигнальных каскадов на основе пептидов, производных С-концевого участка 612—627 третьей ЦП (С-ЦП-3) рецептора ТТГ, а также в изучении активности пептидов в условиях in vitro по их влиянию на базальный и стимулированный гормонами уровень ГТФ-связыва-ния гетеротримерных Gs- и Gq-белков, компонентов этих каскадов, и по влиянию в условиях in vivo интраназального введения пептидов на уровень тиреоидных гормонов в плазме крови экспериментальных животных. Следует отметить, что мутации в С-ЦП-3 рецептора ТТГ нарушают его взаимодействие с Gg-белками и приводят к потере способности мутантного рецептора стимулировать активность аденилатциклазы и цАМФ-за-висимых сигнальных каскадов [10].
С помощью твердофазного синтеза были синтезированы пептид Gln-Tyr-Asn-Pro-Arg-Asp-Lys-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Arg-Nle-Ala612-627-Lys-Ala-амид (I), в котором Met626 заменен на близкий ему по физико-химическим свойствам норлейцин, а также пальмитоилированный аналог этого пептида (II), в котором боковая s-аминогруппа остатка лизина, следующего за Ala627, модифицирована остатком пальмитиновой кислоты. С-концевые остатки лизина и аланина, следующие за Ala627, были введены в структуру пептида для его модификации пальмитоильным радикалом. Синтез пептидов проводили на пара-метилбензгид-риламинной смоле емкостью 1.16 ммоль/г с помощью синтезатора NPS-4000 ("Neosystem Laboratoires", Франция). s-Пальмитоилированный лизин получали конденсацией пентафторфенилового эфира пальмитиновой кислоты и Na-трет-бути-локсикарбониллизина с помощью дициклогек-силкарбодиимида в присутствии триэтиламина, как описано ранее [8]. Структура пептидов была подтверждена данными аминокислотного и масс-спектрометрического анализов, которые показали, что Мэксп пептида I равна 1915.10 (Мрассч =
124
ШПАКОВА и др.
% 180
160 140 120 100 80
60
пептид I пептид II
-lg [пептид], M
Рис. 1. Стимулирующий эффект пептидов, производных С-ЦП-3 рецептора ТТГ, на базальный уровень ГТФ-связывания в мембранах щитовидной железы крыс. Ордината — ГТФ-связывание. Базальный уровень ГТФ-связывания, который составил 1.22 ± 0.09 пмоль [8-3Н]ОррМНр на 1 мг мембранного белка, принят за 100%.
1915.08), M 2336.43).
1 пептида II равна 2336.50 (M
рассч
Фракции частично очищенных плазматических мембран из тканей щитовидной железы самцов крыс линии Wistar выделяли по методу [11], фракции плазматических мембран из тканей мозга и семенников выделяли, как описано ранее [6]. Для получения каждой фракции брали 10—12 крыс. ГТФ-связывание G-белков определяли, как описано ранее [12], используя Р,у-имидо[8-3Н]-гуанозин-5'-трифосфат ([8-3H]GppNHp) (5 Ки/ммоль) ("Am-ersham", Англия). Специфическое ГТФ-связывание рассчитывали как разность между связыванием меченого [8-3H]GppNHp в пробе в отсутствие и в присутствии 10 мМ ГТФ. АДФ-рибозилирова-ние мембран, выделенных из щитовидной железы, с помощью холерного и коклюшного токсинов (ХТ и КТ) проводили, как описано ранее [6]. Для выявления влияния пептидов на ГТФ-связы-вание G-белков мембранные фракции инкубировали с пептидами при 4°C в течение 10 мин.
В экспериментах in vivo использовали самцов крыс линии Wistar (масса животных — 205 ± 15 г), которых разделили на три группы. Группе 1 (контроль, n = 8) вместо пептида вводили физиологический раствор, группе 2 (n = 8) — пальмитоили-рованный пептид II в дозе 90 мкг/кг массы, группе 3 (n = 8) — тот же пептид в дозе 450 мкг/кг массы. Интраназальное введение пептида II осуществляли в два этапа: ежедневно в течение
5 дней, затем перерыв 10 дней и повторное еже-
дневное введение в течение 10 дней. Забор крови из хвостовой вены осуществляли четырежды — за день до начала введения пептида, через четыре дня после окончания первого этапа, за день до начала и через четыре дня после окончания второго этапа введения пептида. Концентрацию тиреоид-ных гормонов — общего трийодтиронина (Т3) и свободного тироксина (Т4) — в сыворотке крови крыс определяли с помощью наборов для имму-ноферментного определения фирмы "Алкор-Био" (Россия).
Пальмитоилированный пептид II дозозависи-мым способом повышал базальный уровень ГТФ-связывания О-белков во фракциях мембран щитовидной железы, в то время как пептид I был намного менее эффективен и отчетливо стимулировал ГТФ-связывание только в концентрации 10-3 М (рис. 1). Стимулирующий эффект пептида II достигал максимума при его концентрации 10-4 М, значение ЕС50 составило 16 мкМ. В мембранах, обработанных КТ, который инактивирует а-субъ-единицу О^0-белков, стимулирующие эффекты обоих пептидов на ГТФ-связывание сохранялись, в то время как при обработке мембран ХТ, который блокирует ГТФазную активность а-субъеди-ницы О8-белков, выключая их из сигнальной трансдукции, соответствующие эффекты пептидов в значительной степени ослаблялись. Так, эффект 10-4 М пептида II в мембранах, обработанных ХТ, составил 47% от такового в необработанных мембранах. Полученные данные указывают на то, что пальмитоилированный пептид II с высокой эффективностью в микромолярных концентрациях повышает базальный уровень ГТФ-связывания в мембранах щитовидной железы крыс, причем его действие реализуется в отношении чувствительных к ХТ О8-белков и, предположительно, Од-белков, нечувствительных как к ХТ, так и к КТ, но не затрагивает чувствительные к КТ Огбелки. Специфичность действия пептида II в отношении О-белков совпадает с таковой для рецептора ТТГ, производным структуры которого он является [10]. Тот факт, что пальмитоилиро-ванный пептид намного активнее немодифици-рованного аналога, хорошо согласуется с ранее полученными нами и группой Кулиопулоса данными о более высокой активности пептидов, модифицированных гидрофобными радикалами [3-6, 8].
Обработка мембран щитовидной железы 10-8 М ТТГ крысы приводила к повышению базального уровня ГТФ-связывания до 2.60 ± 0.19 пмоль [8-3Н]ОррМНр на 1 мг мембранного белка (+113%). В присутствии пептидов I и II стимулирующий эффект гормона снижался, в наибольшей степени в случае пептида II (рис. 2). Это указывает на ингибирование пептидами передачи гормонального сигнала через гомологичный им рецептор
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ IN VITRO И IN VIVO ПЕПТИДОВ
125
-^[пептид], M
Рис. 2. Ингибирующее влияние пептидов, производных С-ЦП-3 рецептора ТТГ, на стимуляцию ТТГ ба-зального уровня ГТФ-связывания. Ордината — стимулирующий эффект ТТГ на ГТФ-связывание. Эффект гормона в отсутствие пептидов принят за 100%.
ТТГ. Для исследования рецепторной специфичности пептидов изучали их влияние на стимуляцию ГТФ-связывания хорионическим гонадо-тропином человека (ХГЧ) и серотонином, которые также активируют О8-белки. Пептид I в концентрации 10-4 М не влиял на стимулирующие ГТФ-связывание эффекты ХГЧ (10-8 М) в семенниках и серотонина (10-5 М) в мозге крыс, в то время как пептид II в этой концентрации лишь незначительно их снижал — эффект ХГЧ на 15%, серотонина на 10%. Оба пептида практически не влияли на базальный уровень ГТФ-связывания О-белков в мембранах мозга и семенников крыс, за исключением незначительного повышения (на 15%) уровня базального ГТФ-связывания в семенниках в присутствии пептида II (10-4 М). Совокупность этих данных указывает на то, что пептиды, производные С-ЦП-3 рецептора ТТГ, специфичны по отношению к гомологичным им рецепторам ТТГ и наиболее активны в щитовидной железе, обогащенной этими рецепторами.
Уровни Т3 и свободного Т4 в сыворотке крови контрольных крыс (группа 1) составили 2.27 ± ± 0.31 нМ и 19.4 ± 1.9 пМ, соответственно. Интра-назальное введение животным пептида II в дозе 450 мкг/кг массы (группа 3) вызывало изменение уровня свободного Т4, причем если после первой, 5-дневной, серии уровень Т4 повышался на 34%, то после второй, 10-дневной, он, напротив, снижался на 23% (рис. 3). В случае обработки животных пе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.