ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 452, № 4, с. 453-456
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПЕПТИДА 562-572 РЕЦЕПТОРА ЛЮТЕИНЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА КРЫСЫ © 2013 г. Е. А. Шпакова, К. В. Деркач, А. О. Шпаков
Представлено академиком Н.П. Веселкиным 28.01.2013 г. Поступило 11.02.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213290240
Одним из направлений поиска высокоактивных регуляторов гормональных сигнальных систем является разработка пептидов, которые по первичной структуре соответствуют участкам ци-топлазматических петель рецепторов серпантинного типа и способны модулировать и регулировать функциональную активность гомологичных им рецепторов [1—4]. Ранее нами и другими авторами было показано, что модификация таких пептидов липофильными радикалами приводит к повышению эффективности и селективности их действия в сравнении с немодифицированными аналогами [5—10]. Так, ацилированный с С-конца остатком пальмитиновой кислоты пептид 612—627, соответствующий третьей цитоплазматической петле рецептора тиреотропного гормона, обладал более высокой биологической активностью in vitro в сравнении с не модифицированным аналогом и стимулировал секрецию тиреоидных гормонов щитовидной железой при применении in vivo [10]. Однако малоисследованным остается вопрос о том, как биологическая активность пептида зависит от локализации в нем липофильных остатков, их числа и химической природы. Предполагается, что гидрофобный радикал мимикрирует трансмембранный домен рецептора, который граничит с соответствующим пептиду цито-плазматическим участком [3, 4]. Вследствие этого гидрофобный радикал должен быть локализован в проксимальном к мембране сегменте пептида и сопоставим по размеру с трансмембранным доменом, обеспечивая заякоривание и правильную ориентацию модифицированного пептида в мембране.
Для проверки этой гипотезы нами были синтезированы липофильные производные пептида
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
562—572, соответствующего С-концевому участку рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГР) крысы, и проведено сравнительное изучение их влияния на базальную активность фермента аде-нилатциклазы (АЦ), каталитического компонента аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС), и регуляцию АЦ хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) в тестикулярных мембранах крыс. ХГЧ является структурным и функциональным гомологом ЛГ, специфично связывается с ЛГР и активирует АЦ через посредство гетеротример-ных G-белков стимулирующего типа [11]. Следует отметить, что ЛГ играет ключевую роль в регуляции синтеза и секреции стероидных гормонов репродуктивной тканью, контролирует сперматогенез, фолликулогенез и оогенез [12, 13]. Для выяснения влияния локализации гидрофобных радикалов и их числа на активность пептида 562—572 осуществляли его модификацию только с N- или С-конца или с обоих концов. Для изучения влияния гидрофобности радикала изучали остатки пальмитиновой (С15Н31—CO) и декановой (C9H19—CO) кислот.
С помощью твердофазной стратегии с использованием синтезатора NPS-4000 ("Neosystem Laboratoires", Франция) были впервые синтезированы четыре липофильных производных ЛГР-пеп-тида 562—572, модифицированные остатком декановой кислоты (Dec) с N-конца, C-конца и с обоих концов или остатком пальмитиновой кислоты (Palm) с N-конца: Asn-Lys(Dec)-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Lys-Nle-Ala562-572-Lys-Ala-амид (пептид 1), Asn-Lys-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Lys-Nle-Ala562-572-Lys(Dec)-Ala-амид (2), Asn-Lys(Dec)-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Lys-Nle-Ala562-572-Lys(Dec)-Ala-амид (3) и Asn-Lys(Palm)-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Lys-Nle-Ala562-572-Lys-Ala-амид (4). Для сравнения были взяты синтезированные и изученные ранее немодифицированный пептид Asn-Lys-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-Lys-Nle-Ala562-572-амид (5) и его аналог Asn-Lys-Asp-Thr-Lys-Ile-Ala-Lys-
454
ШПАКОВА и др.
-^[ЛГР-пептид]
Рис. 1. Стимулирующий эффект липофильных производных ЛГР-пептида 562—572 на базальную активность аденилатциклазы (АЦ) в тестикулярных мембранах крыс.
Здесь и на рис. 2: 1—6 — пептиды 1—6. Ордината — активность АЦ, пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка; абсцисса — отрицательный десятичный логарифм концентрации производного ЛГР-пептида, М.
Ьу8-Ме-А1а562_572-Ьу8(Ра1ш)-А1а-амид (6), модифицированный с С-конца остатком пальмитиновой кислоты [9].
Синтез пептидов проводили на пара-метил-бензгидриламинной смоле (емкость 1.16 ммоль/г), используя защищенные Ма-трет-бутилоксикарбо-нильными (Вое) группами производные аминокислот. Для образования пептидной связи применяли метод активированных эфиров. 1-Оксибен-зотриазолиловые эфиры аминокислот получали с помощью М,М-диизопропилкарбодиимида. Раствор 1-оксибензотриазолилового эфира Вое-ами-нокислоты добавляли к пептидил-полимеру со свободными аминогруппами. Для достижения полноты ацилирования использовали трехкратный избыток ацилирующего агента, реакцию проводили в течение суток. Деблокирование и снятие пептида с полимера вели с использованием трифторметансульфокислоты (1 мл) в три-фторуксусной кислоте (10 мл) в присутствии ска-венджеров — тиоанизола (1 мл) и этандитиола (0.5 мл) (все количества на 1 г пептидил-полиме-ра) — в течение 1 ч при охлаждении льдом и еще 1.5 ч без охлаждения. Затем добавляли 100 мл ди-этилового эфира, выпавший осадок отделяли фильтрованием, растворяли в 5 мл трифторуксус-ной кислоты, фильтровали для удаления смолы и осаждали 100 мл сухого диэтилового эфира. Для введения остатков пальмитиновой и декановой кислот в пептидную цепь использовали липо-
фильные производные лизина, которые получали конденсацией лизина, имеющего свободную 8-аминогруппу, с пентафторфениловыми эфира-ми пальмитиновой или декановой кислот в присутствии триэтиламина. Липофильные производные пептидов очищали с помощью обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), для подтверждения их структуры проводили масс-спектрометрический анализ, который показал, что Мэксп пептида 1 равна 1381.92
(Мрассч 1382.02), МЭКсп пептида 2 - 1381.89
(Мрассч 1382.02), Мэксп пептида 3 - 1735.39
(Мрассч 1735.41), Мэксп пептида 4 - 1665.13
(Мрассч 1665.16), Мэксп пептида 5 - 1227.67
(Мрассч 1227.64), МэксП пептида 6 - 1665.13
(Мрассч 1665.14). Необходимо отметить, что
ЛГР-пептид 562—572, модифицированный остатками пальмитиновой кислоты с N- и C-концов, был высокогидрофобным, не растворялся в водных растворителях и не мог быть использован в биологических экспериментах.
Выделение фракций плазматических мембран из семенников шестимесячных крыс Wistar и определение в них активности АЦ проводили, как описано ранее [9]. Для получения каждой фракции брали 7—8 животных. Инкубацию мембран в реакционной смеси проводили при 37 °C в течение 12 мин. Активность АЦ определяли с помощью [а-32Р]АТФ (1000 Ки/ммоль) производства ОАО "Институт реакторных материалов" (Россия) и выражали в пикомолях цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка. В опытах использовали ХГЧ, питуитарный АЦ-активирующий полипептид (PACAP-38) и другие реактивы фирм "Sigma" (США) и "Fluka" (Швейцария).
Статистический анализ данных проводили с использованием программы ANOVA. Данные представлены в виде М ± S.E.M. из трех независимых экспериментов. Различия оценивали как достоверные при P< 0.05.
Исследование влияния липофильных производных ЛГР-пептида 562-572 (10-7-10-3 М) на базальную активность АЦ в тестикулярных мембранах показало, что наиболее активен среди них пептид 6, модифицированный с C-конца пальми-татом (рис. 1). В концентрации 10-5 М он в два раза повышал базальную активность фермента и при повышении концентрации до 10-3 М его эффект практически не менялся. Модифицированные с С-конца деканоатом пептиды 2 и 3 были менее эффективны, а их АЦ-эффекты были сопоставимы с таковым немодифицированного пептида 5. Следует, однако, отметить, что если АЦ-эффекты пептидов 2 и 5 усиливались при повышении их концентрации с 10-5 до 10-3 М, то АЦ-эффект пептида 3 с двумя деканоильными остатками достигал максимума при концентрации 10-5 М
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
455
(+58%) и далее уже не повышался. Пептиды 1 и 4, ацилированные с Оконца, практически не влияли на базальную активность фермента (рис. 1). Полученные данные указывают на способность ацилированных с С-конца производных ЛГР-пептида 562—572 мимикрировать активированный гормоном рецептор и повышать базальную активность АЦ. Большое значение имеет длина липофильного остатка, поскольку пептид 6, модифицированный пальмитатом, был намного активнее пептида 2, модифицированного более коротким деканоатом. Пептиды, ацилированные с Оконца, были мало активны и по способности стимулировать базальную активность АЦ уступали даже немодифицированному пептиду 5.
Таким образом, наши данные подтверждают гипотезу о том, что гидрофобный радикал в пептиде должен быть локализован в той позиции, в которой в нативном рецепторе расположен трансмембранный домен. Действие пептидов характеризовалось тканевой специфичностью. Так, наиболее активные пептиды 3 и 6 (10-4 М) слабо влияли на базальную активность АЦ в миокар-диальных и синаптосомальных мембранах, выделенных из миокарда и тканей мозга крыс (данные не представлены), где гомологичные пептидам рецепторы (ЛГР) отсутствуют или экспрессиру-ются в очень незначительной степени [12, 14]. Эти данные подтверждают точку зрения, что в основе действия пептидов, производных рецепторов серпантинного типа, лежит их способность взаимодействовать с комплементарными участками гомологичного им рецептора, в нашем случае ЛГР [3, 4, 8, 15].
Далее в тестикулярных мембранах изучали влияние пептидов на стимулирующий АЦ-эф-фект ХГЧ (10-8 М), который в их отсутствие составил 658%. Фракции мембран преинкубирова-ли (5 мин, 4°С) с пептидами, затем добавляли ХГЧ. В присутствии 10-5 и 10-4 М пептида 6, модифицированного с С-конца пальмитатом, АЦ-эффект ХГЧ составил 49 и 32% от такового в контроле (рис. 2). Значительное снижение АЦ-эф-фекта гормона наблюдалось и в присутствии пептидов 2 и 3, модифицированных с С-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.