ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 4, с. 434-440
УДК 576.385.35;577.112.083;57.085.23
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ ГЕПАТОПАНКРЕАСА
КАМЧАТСКОГО КРАБА
© 2015 г. В. В. Богданов*, Б. Б. Березин*, А. П. Ильина*, В. П. Ямскова**, И. А. Ямсков*
* Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: vse-bogd@yandex.ru ** Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334 Поступила в редакцию 23.10.2014 г.
Выделенные из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus вещества пептидной природы проявляли физико-химические свойства, мембранотропную и специфическую активности, сходные c мембранотропными гомеостатическими тканеспецифическими биорегуляторами, ранее обнаруженными в различных тканях млекопитающих и растений. Продемонстрировано их биологическое действие на ткани позвоночного на модели роллерного органотипического культивирования ткани печени тритона Pleurodeles waltl.
Ключевые слова: гепатопанкреас, биорегуляторы, роллерное культивирование. DOI: 10.7868/S0555109915040030
Мембранотропные гомеостатические ткане-специфические биорегуляторы (МГТБ) представляют собой группу биологически активных веществ, обладающих рядом сходных физико-химических свойств и характером биологического действия. МГТБ впервые были обнаружены в различных тканях позвоночных животных, затем в растениях и грибах [1—3]. МГТБ локализованы в тканях внеклеточно. В сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10-8—1015 мг белка они могут участвать в регуляции таких процессов, как клеточная пролиферация, миграция и дифференци-ровка, адгезия клеток [1]. В СМД биорегуляторы способствуют увеличению жизнеспособности клеток при культивировании in vitro, а также стимулируют процессы восстановления и репарации в травмированных и патологически измененных тканях [4, 5]. Биологическая активность МГТБ и входящих в их состав пептидов характерна для определенных тканей, но не имеет видовой специфичности.
МГТБ имеют сложное строение. За проявление биологического действия ответственны низкомолекулярные пептиды (до 6000 Да), а также белки, модулирующие их активность — белки-модуляторы [6].
В представленной работе впервые предпринята попытка обнаружения в тканях беспозвоночных животных веществ, проявляющих свойства, аналогичные свойствам МГТБ. Объектом исследования стала ткань гепатопанкреаса краба камчатского. Данный орган входит в пищеварительную систему у членистоногих и выполняет функции,
аналогичные таковым у двух желез позвоночных животных: печени и поджелудочной железы. Гепатопанкреас состоит из пучков трубочек, которые представляют собой полости для переваривания и всасывания пищи, а также создания запаса липидов и минеральных веществ. Трубочки образованы четырьмя типами клеток. Клетки Е-типа, "эмбриональные", расположены в "тупиках" трубочек и являются предшественниками трех остальных типов клеток. Клетки Б-типа, "фибриллярные", расположены базально и имеют развитой эн-доплазматический ретикулум. Их функции весьма разнообразны: от синтеза белков до запасания питательных веществ. Клетки В-типа, "блистеры", содержат огромные везикулы, погруженные в плотную цитоплазму, и их функцией является выработка пищеварительных ферментов. Наконец, самыми многочисленными являются цилиндрической формы Я-клетки с развитой поверхностью цитоплазматической мембраны, которая обеспечивает всасывание ферментированной пищи [7].
Цель работы — выделение биологически активных пептидов из гепатопанкреаса камчатского краба, изучение их физико-химических свойств, мембранотропной и специфической активности.
МЕТОДИКА
Получение тканевого экстракта. Замороженный гепатопанкреас Камчатского краба (РагаШН-ойгз сат18сНаист) нарезали на мелкие фрагменты и экстрагировали физиологическим раствором для тканей ракообразных, следующего состава
(г/100 мл): NaCl - 2.92; KCl - 0.075; CaCl - 0.44, при 4°С в течение 4 ч из расчета 500 мл на 100 мг ткани. Через 4 ч экстракт центрифугировали при 5000 g 30 мин, в супернатант добавляли сухой сульфат аммония (780 г/л) и выдерживали при 0—4° С 72 ч. Осадок отделяли центрифугированием при 15000 g 30 мин. Надосадочную жидкость и отдельно осадок диализовали до полного удаления ионов аммония, контролируя присутствие иона по реакции с реактивом Несслера, и далее исследовали на проявление мембранотропной активности адгезиометрическим методом.
Адгезиометрический метод. Данный метод разработан нами ранее для обнаружения МГТБ в исследуемых растворах путем измерения их влияния на вязкоупругие свойства клеточных мембран [8]. Эксперименты проводили на культурах печени мышей-гибридов С57В1/СВА (18-20 г, самцы) in vitro. Фрагменты ткани печени массой 0.7-1.5 мг помещали в пенициллиновые флаконы (по 5 штук) и инкубировали. В контрольной серии фрагменты ткани печени помещали в 1 мл среды 199 [9], в опытной серии - в 1 мл раствора исследуемой фракции, который получали последовательным 10-кратным разбавлением ее в среде 199. Для получения разведений к 0.1 мл исследуемой фракции (супернатант либо фракции после ВЭЖХ) добавляли 0.9 мл среды 199 и интенсивно встряхивали 10-15 раз, 0.1 мл раствора переносили в другой сосуд и добавляли 0.9 мл питательной среды и вновь встряхивали. Эту процедуру повторяли до разбавления исследуемого раствора в 1015 раз.
После инкубирования в течение 120 мин при 37°С каждый фрагмент печени как в контрольной, так и опытной серии извлекали, удаляли излишек среды фильтровальной бумагой, взвешивали с точностью до 0.1 мг и диспергировали в 0.1 мл 0.1%-ного раствора трипанового синего в среде 199, используя стеклянный гомогенизатор с зазором 50 мкм. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер помещали в камеру Горяе-ва. Под микроскопом просчитывали количество выделившихся из поврежденных клеток и окрасившихся трипановым синим клеточных ядер в поле камеры. Для каждого разведения исследуемой фракции просчитывали не менее 5 фрагментов печени, каждый из которых после гомогенизации помещался в отдельную камеру. Данные обрабатывали статистически, используя критерий Стьюдента. Каждый эксперимент проводили не менее 3 раз. При исследовании активной фракции наблюдалось сохранение целостности клеток, выражавшееся в уменьшении количества выделившихся и окрашенных клеточных ядер в суспензии относительно контроля (количество ядер в каждом случае рассчитывали на массу фрагмен-
та). Мембранотропную активность рассчитывали по формуле:
Ма = 200% - [(NÄ) х 100%],
где Ма — параметр, характеризующий мембранотропную активность; Nail и NK — количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани, в опыте (тканевые культуры в присутствии исследуемого вещества) и в контроле соответственно. О наличии мембранотропной активности судили по превышению значения Ма более чем на 125%.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Хроматографию проводили на приборе Agilent 1100 Series ("Conquer Scientific", США). 100 мкл супернатанта, полученного после осаждения сульфатом аммония экстракта гепатопанкреаса разделяли на колонке С8-200 ("Биохиммак", Россия) в градиенте вода — ацетонитрил от 3 до 40% ацетонитрила в присутствии 0.1%-ной трифторуксусной кислоты при скорости элюции 0.5 мл/мин в течение 30 мин. Детекцию фракций белков проводили спектро-фотометрически при длине волны 280 нм. Для наработки ВЭЖХ-фракций разделение повторяли многократно.
Динамическое лазерное светорассеяние. Определение размеров наночастиц (молекулярных ассо-циатов биорегулятора) в исследуемом супернатан-те осуществляли методом лазерного динамического светорассеяния на приборе "Zetasizer Nano" фирмы "Malvern" (Англия). Перед внесением раствора в кювету его пропускали через мембранные фильтры "Millipore" с размером пор 0.22 мкм (США). На приборе получали не менее 3 серий измерений (прибор автоматически снимает серию из 11 измерений). Обсчет полученных данных с построением графика проводили с помощью программы Zetasizer v. 7.01.
MALDI-TOF-масс-спектрометрия. Анализ молекулярной массы белков, входящих в исследуемую фракцию (супернатанта, либо ВЭЖХ-фрак-ции), проводили на времяпролетном масс-спектрометре Braker UltraFlex 2 ("Braker Daltonic", Германия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в линейном режиме и режиме отражения, определяя положительные ионы. Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений молекулярных масс известных белков. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 серий спектров по 50 импульсов лазера для каждой. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы "Braker Daltonics" (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Точность измерения масс составляла ±2 Да. В качестве матрицы использовали насыщенный раствор а-циа-но-4-гидроксикоричной кислоты ("Sigma-Aldrich",
Ma, 180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
%
il
il
il
il
il
il
il
il
K 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
il
nh
rh
rti il
ii
lg разведения
Рис. 1. Зависимость мембранотропной активности (Ма) фракции супернатанта, полученного из экстракта гепато-панкреаса краба от его концентрации в эксперименте. Светлые столбцы соответствуют активным фракциям. К (контроль) — без добавления препарата.
Германия) в смеси 50%-ного ацетонитрила и 2.5%-ной трифторуксусной кислоты.
Круговой дихроизм. Спектры кругового дихроизма снимали на КД-спектрометре фирмы Jasco модели 720 (Япония) при 25°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Культивирование печени тритона. Исследование проводили на взрослых тритонах Pleurodeles waltl обоего пола, взятых из аквариальной разводки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. После наркотизации животного в 0.1%-ном растворе MS-222 и декапитации из печени вырезали фрагменты размером около 30 мм3. Для культивирования использовали среду следующего состава (мл): среды 199 — 60, дистиллированной воды — 30, эмбриональной телячьей сыворотки — 10, Hepes-буфера — 200 мкл, гентами-цина — 100 мкл. В стерильных условиях во флаконы контрольной серии вносили по 5 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.