ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 348-353
УДК 543.54;543.51;577.1
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ УКРОПА ПАХУЧЕГО Anethum graveolens L.
© 2015 г. О. Г. Куликова*, Д. И. Мальцев*, А. П. Ильина*, А. В. Бурдина*,
В. П. Ямскова**, И. А. Ямсков*
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: koulikova_olga@mail.ru **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334 e-mail: yamskova-vp@yandex.ru Поступила в редакцию 21.10.2014 г.
Из листьев укропа пахучего Anethum graveolens L. выделена смесь пептидов с молекулярными массами 1000—2000 Да, которые в сверхмалых дозах проявляли in vitro мембранотропную активность по отношению к культуре гепатоцитов мыши. Было установлено, что растительные пептиды в водном растворе образовывали крупные наноразмерные частицы размером примерно 90 нм, обладающие вторичной структурой, которая преимущественно состояла из Р-структур и статистического клубка. На модели роллерного органотипического культивирования печени тритона показано, что в сверхмалых дозах пептиды, выделенные из A. graveolens, in vitro оказывали влияние на размер площади пигментированных клеток печени амфибии, являющихся аналогом Купфферовских клеток печени млекопитающих. Это указывало на их участие в гепатопротекторном действии A. graveolens.
Ключевые слова: растения, пептиды, культивирование, гепатопротекция. DOI: 10.7868/S0555109915030113
Растения являются традиционными источниками различных биологически активных веществ, многие из которых к настоящему времени недостаточно изучены и охарактеризованы [1, 2], например, вещества, влияющие на такие важнейшие биологические процессы, как миграция, адгезия, дифференцировка и пролиферация клеток. Особого внимания заслуживают исследования новой группы растительных биологически активных биорегуляторов — мембранотропных го-меостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые в настоящее время были обнаружены также в различных тканях позвоночных животных и грибах [3]. Установлено, что МГТБ животного происхождения представляют собой пептидно-белковые комплексы, локализованные вне клеток. Активность МГТБ определяют небольшие пептиды с молекулярной массой 1000—6000 Да, связанные с белками, модулирующими их биологическое действие [4—7]. Отличительными свойствами МГТБ являются проявление активности в сверхмалых дозах (СМД) и их тканевая, но не видовая специфичность, а также способность стимулировать процессы восстановления и репарации в травмированных или патологически измененных тканях за счет дополнительной активации клеточных источников регенерации [3, 8].
Все члены данной группы биорегуляторов проявляют сходные физико-химические свойства [7]. В связи с этим для их выделения из различных источников и дальнейшей очистки применяется экспериментальный подход, включающий экстракцию из тканей и ряд традиционных биохимических методов.
Ранее было показано, что МГТБ, выделенные из лука и подорожника, содержат небольшие пептиды, которые проявляют мембранотропную активность в СМД, а их специфическая активность коррелирует с лекарственным свойством растения [9, 10].
Укроп пахучий (A. graveolens L.) представляет собой травянистое растение семейства зонтичных (Umbelliferae), которое широко используется в качестве пищевой добавки. В нем содержатся эфирные и жирные масла, вода, белки, углеводы, различные минеральные элементы и др. Кроме того, препараты из A. graveolens обладают антибактериальными, антиспазматическими и гепа-топротекторными свойствами [11].
Цель работы — изучение состава и физико-химических свойств пептидной фракции, выделенной из экстракта листьев укропа пахучего A. graveo-lens, а также ее специфического биологического действия in vitro на ткани животного происхождения.
МЕТОДИКА
Укроп пахучий (Anethum graveolens L.) получен из питомника главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. В работе использовали очищенную воду (18 МОм), ацетонитрил, изопропанол, уксусную и трифторуксусную кислоты, меркаптоэтанол, соляную кислоту, этиловый спирт, ацетон, о-кси-лол, KCl, KH2PO4 и сульфат аммония ("Реахим", Россия), трис, додецилсульфат натрия (ДДС-Na), дитиотреитол и трипановый синий ("Serva", Германия), акриламид, метилен-бис-акрила-мид, персульфат аммония, N, N, N', N'-тетраметил-этилендиамин (ТЭМЭД), NaH2PO4, Na2HPO4, твин-20 и бицинхониновая кислота ("Sigma", США), кумасси G-250 ("Eastman", США); сульфат меди ("Merk", Германия) и среду 199 —(Институт полиомиелита, Россия).
Органотипическое культивирование ткани печени тритона и мыши проводили в питательной среде 199. Биологическую активность пептидных фракций растения исследовали на мышах-гибридах F1 линии C57BL/CBA (самцы весом 18—20 г), а также на взрослых половозрелых тритонах (Pleurodeles waltl) обоего пола, содержащихся в стандартных условиях. В работе был использован роллер марки "Assistant RM5" (Германия). Центрифугирование проводили на центрифуге Т32А ("Janetzki", Германия). В работе также использовали прибор для вертикального электрофореза Mini vertical gel system EC120 ("BioRad", США), источник тока для электрофореза PowerPac Basic ("BioRad", США), спектрофотометр Ultrospec 1100 pro, ("Biochrom Ltd.", Англия), микроскопы световые Jenaval ("Carl Zeiss", Германия) и Olympus Vanox AHBT3 (Япония), цифровую камеру Olympus U-PMTVC (Япония), рН-метр Oakton 2100 ("EUTECH Instruments", Сингапур), ультразвуковую баню Transsonic Digital ("Elma", Швейцария). Спектры кругового дихроизма в УФ-об-ласти (195—260 нм) снимали на КД-спектрометре Jasco 720 (Япония) при 20° C в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 мм.
Для экстракции пептидной фракции 1700 г листьев и стеблей укропа, которые нарезали на фрагменты размером 1—1.5 см, помещали в 3 л раствора следующего состава (М): NH4NO3 — 2.06 х 10-2, KNO3 - 1.88 х 10-2, М CaCl2 - 3 х 10-3, MgSO4 -1.5 х 10-3, KH2PO4 - 1.25 х 10-3. Смесь инкубировали в течение 4-5 ч при 4°C. В экстракт, полученный после центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин., при постоянном перемешивании добавляли сухой сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л), поддерживая значение рН 7.5-8.0 гидроксидом аммония. В полученную смесь добавляли 0.01 М азид натрия и инкубировали в течение на 7-8 сут при 4°C. Для удаления ионов аммония фракции надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка,
полученные после центрифугирования при 10000 g в течение 30 мин, диализовали при 4°С против воды (при соотношении объемов фракции и воды 1 : 50). Супернатант концентрировали на вакуумном роторном испарителе при 36—40°C. Для изучения специфической активности полученных растительных пептидов на модели роллерного ор-ганотипического культивирования печени тритона in vitro супернатант фракционировали биохимическими методами.
Концентрацию белка определяли по методу Лоури.
Электрофорез белков в 12.5%-ном полиакри-ламидном геле (ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс использовали белки-маркеры ("Sigma-Aldrich", США): а-лакталь-бумин — 14200 Да, соевый ингибитор трипсина — 20000 Да, трипсиноген из поджелудочной железы быка — 24 000 Да, карбоангидраза — 29 000 Да, гли-церальдегид-3-фосфатгидрогеназа — 36000 Да, овальбумин — 45000 Да, альбумин — 66000 Да. Гели окрашивали Кумасси G-250.
Анализ молекулярной массы пептидов проводили методом времяпролетной масс-спектромет-рии с ионизацией в матрице (MALDI-TOF) на масс-спектрометре UltraFlex 2 ("Bruker Daltonic", Германия). Образец для масс-спектрометриче-ского анализа упаривали досуха и затем растворяли в 70%-ном растворе ацетонитрила, содержащем 0.1%-ную трифторуксусную кислоту. В качестве матрицы в работе использовали а-циано-4-гидрок-сикоричную кислоту.
Гидродинамический радиус частиц в суперна-танте определяли методом динамического лазерного светорассеяния на приборе PhotoCor Complex ("ФотоКор", Россия), снабженном автоматическим гониометром, псевдокорреляционной системой счета фотонов PhotoCor, одноплатным мультивременным коррелятором реального времени PhotoCor FC в логарифмической конфигурации (интервал времен задержки 0.01—5 х 105 мс) и гелий-неоновым лазером Uniphase 1135Р мощностью 20 мВт с длиной волны 633 нм. Измерения проводили при 23°С в интервале величин угла рассеивания 60—120°С. Растворы, содержащие пептиды, предварительно очищали от пыли фильтрованием через мембраны Durapore с диаметром пор 0.45 мкм ("Millipore", США).
Вторичную структуру белка определяли методом кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма снимали в УФ-области (195—260 нм) со скоростью сканирования 50 нм/мин, шагом — 1 нм, накоплением каждого шага — 2 с. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных трех измерений и вычитания спектра базовой линии (контроля). Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью про-
350
КУЛИКОВА и др.
Ma, 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
%
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Рис. 1. Мембранотропное действие (Ма, %) супернатанта экстракта А. Graveolens. К — контроль; по оси абсцисс отложена степень 10-кратного последовательного разведения препарата, (р < 0.05). Исходная концентрация белка в супер-натанте — 0.1 мг/мл.
граммы CDNN (HYPERLINK http://bioinformatik. biochemtech.uni-halle.de/cdnn).
Полученный супернатант экстракта укропа подвергали обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на гидрофобной колонке Kromasil C18 (Россия) (4.6 х х 250 мм) с использованием хроматографа высокого давления фирмы ("Kontron", США). Элю-цию осуществляли градиентом концентрации ацетонитрила (4—70%) в 0.1%-ной трифторуксус-ной кислоте (pH 2.2) со скоростью 0.5 мл/мин в течение 70 мин. Детекцию проводили при 220 нм.
Для изучения мембранотропной активности полученных фракций использовали разработанный ранее метод идентификации МГТБ, включающий кратковременное органное культивирование печени мыши in vitro — (метод биотестирования) [3]. Для каждой фракции эксперимент проводили не менее 3 раз. Статистическую обработку данных осуществляли методом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.