ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 551-557
УДК 579.852.11
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩЕГО ШТАММА Bacillus subtilis ИМВ В-7023
© 2004 г. Ä. Ä. Рой, О. Н. Рева, И. К. Курдиш, В. В. Смирнов
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев, 03143;
e-mail: kurdish@serv.imv.kiev.ua Поступила в редакцию 14.03.2003 г.
Представлены биологические характеристики нового фосфатмобилизующего штамма бацилл. Видовая идентификация штамма проводилась по морфолого-культуральным и биохимическим признакам, а также по сиквенсу гена 16S рРНК. Штамм определен как Bacillus subtilis ИМВ В-7023 и характеризовался высокой активностью мобилизации фосфора из его труднорастворимых неорганических и органических соединений, синтезом биологически активных веществ, существенно угнетал рост фитопатогенных бактерий и микромицетов, возбудителей болезней овощных, злаковых, бобовых и др. растений. Штамм Bacillus subtilis ИМВ В-7023 перспективен для создания бактериальных препаратов для растениеводства.
Фосфор является одним из основных элементов, определяющих развитие и урожай растений. Несмотря на то, что его валовые запасы в основных типах почв Украины составляют от 3.8 до 22.9 т/га, значительные количества фосфора находятся в труднодоступных для растений органических и неорганических соединениях [1].
Важнейшая роль в обеспечении растений источником фосфорного питания принадлежит микроорганизмам, в том числе и бактериям рода Bacillus [1-3]. Представители этого рода способны синтезировать широкий спектр биологически активных веществ с различной спецификой действия, в том числе и пестицидной [4]. Спорообра-зующие бактерии отличаются от многих других микроорганизмов более разнообразной и ярко выраженной антимикробной активностью к фи-топатогенам растений, активизируют в них защитные реакции [5-7]. В связи с этим в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины активно ведутся работы по созданию биопрепаратов для растениеводства на основе новых высокоэффективных штаммов микроорганизмов, действующим началом которых являются биологически активные вещества бактериального происхождения.
Цель работы - изучение биологических свойств нового фосфатмобилизирующего штамма Bacillus subtilis ИМВ В-7023.
МЕТОДИКА
Фосфатмобилизующий штамм Bacillus subtilis ИМВ В-7023 был выделен из образцов черноземной почвы Черкасской области Украины.
Видовую принадлежность штамма ИМВ В-7023 определяли по культурально-морфологи-ческим и биохимическим признакам [8, 9] с использованием разработанного ранее ключа идентификации [10], а также по сиквенсу части гена 16S рРНК. Для амплификации 16S рРНК использовали следующие праймеры: 16SF 5'-CGA GCG GAC AGA TGG GAG CTT GC-3' и 16SR 5'-GCC GGG GGC TTT CAC ATC AGA CT-3', сконструированные таким образом, чтобы был амплифи-цирован гипервариабельный локус гена 16S pPHK (нуклеотиды со 115 по 485 с 5' - конца гена), где содержатся нуклеотиды, вариабельные у видов группы Bacillus subtilis. Праймеры разрабатывали, основываясь на анализе известных сиквен-сов генов 16S рРНК, представленных в табл. 1. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводи-
Таблица 1. Сиквенсы генов 16S рРНК, используемые для конструирования праймеров
Штамм Номер, под которым сиквенс зарегистрирован в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
B. subtilis DSM 10T AJ276351
B. subtilis 168 Z99104
B. subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049 AF074970
B. atrophaeus JCM 9070 AB021181
B. vallismortis DSM 11031 AB021198
B. mojavensis IFO 15718 AB021191
B. amyloliquefacie ATCC 23350 X60605
ли на амплификаторе GeneAmp 2400 "Perkin Elmer" (Великобритания) в 50 мкл смеси, содержащей 5 ед./мкл TaKaRa Ex Taq™ ДНК-полимеразы, 5 мкл буфера 10 х Ex Taq™, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, праймеры в концентрации 0.5 мкМ и 5 нг матричной ДНК. Проводили 35 циклов реакции с денатурацией в течение 30 с при 95°C, отжигом в течение 1 мин при 45°C и пролонгацией в течение 2 мин при 72°C. Для сиквенса продукты ПЦР очищали с помощью набора стандартных операций для очистки QIAGEN PCR (Германия). Сиквенирование проводили на приборе CEQ (tm) 2000XL ("Beckman Coulter") в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Для выделения ДНК культуру выращивали в течение 12 ч при 37°C с интенсивным перемешиванием на качалке в колбах со 100 мл питательной среды, содержащей 1% бактериального трип-тона Oxoid (Германия), 0.5% дрожжевого экстракта Oxoid (Германия) и 1% NaCl. Отбирали 2 мл культу-ральной жидкости в пластиковые микропробирки и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин. Затем клетки промывали 2 мл стерильной дистиллированной воды и вновь осаждали центрифугированием. Отмытые клетки суспендировали в 100 мкл буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8.0) с 1% лизоцима. После инкубирования суспензии при 37°C в течение 15 мин для лизиса клеток добавляли 10 мкл 20%-ного раствора ДДС-Na и 15 мкл 15%-ного NaCl. ДНК экстрагировали фенолом и смесью хлороформа с изопро-панолом, отбирая водную фазу, после чего осаждали этанолом. Полученную ДНК растворяли в дистиллированной воде и очищали от РНК с помощью фермента РНКазы A (QIAGEN Германия) (20 нг/мл , 60 мин при 50°C), а от белков - проте-иназой К (QIAGEN Германия) (100 нг/мл, 60 мин при 37°C), после чего ДНК вновь экстрагировали фенолом и хлороформом с изопропанолом в соотношении 24 : 1.
Исследования интенсивности роста и минерализации органических соединений фосфора (глицерофосфат и фитин) в присутствии В. subtilis проводили в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O -0.3; NaCl - 0.3; KCl - 0.3; MnSO4 ■ 5H2O - 0.001; FeSO4 ■ 7H2O - 0.001, глюкоза - 10.0; глицерофосфат или фитин - 1.0 в пересчете на P O4 ; мел -5.0; дистиллированная вода - 1 л [2]. Питательную среду в количестве 100 мл вносили в колбы Эрлен-мейера и инокулировали суспензией с начальным содержанием КОЕ ~1 х 105 в 1 мл. Инкубацию проводили в периодических условиях при 28°C в течение 3 сут при встряхивании на качалке (240 об/мин).
Способность Bacillus subtilis мобилизовать труднорастворимый трикальцийфосфат изучали в жидкой питательной среде следующего состава, (г/л):
(NH4)2SO4 - 0.5; K2SO4 - 0.2; MgSO4 ■ 7H2O - 0.001; FeSO4 ■ 7H2O - 0.001; Ca3(PO4)2 - 2.0, глюкоза - 10.0, дрожжевой экстракт - 2 мл, pH 6.5-7.0 [11].
Ростовую активность культуры оценивали по увеличению количества жизнеспособных клеток в конце опыта методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. О способности культур мобилизовать соединения фосфора судили по приросту биомассы и накоплению в культуральной жидкости фосфат-ионов. Их концентрацию определяли по методу Фиске-Суббароу с использованием молибдата аммония и аскорбиновой кислоты [12].
Антагонистическую активность бацилл к фито-патогенным бактериям и грибам изучали методом отсроченного антагонизма, а к стафилококку - методом блоков, учитывая диаметр зоны (мм) угнетения роста Staphylococcus aureus, шт. 209. Штаммы фитопатогенов получены из Украинской коллекции микроорганизмов НАН Украины. Степень антагонистической активности к фитопатогенам учитывали по величине зоны радиуса отсутствия их роста [13].
Влияние Bacillus subtilis ИМВ В-7023 на прорастание и всхожесть семян различных растений оценивали согласно ГОСТ 12038-84 [14].
Результаты обрабатывали статистически [15].
Для изучения выживания культуры Bacillus subtilis ИМВ В-7023 во внутренних тканях растений использовали модельные растения рапса масличного (Brassica napus L.) сорта Вестар. Поверхность семян стерилизовали 10%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 20 мин, после чего семена промывали 70%-ным этанолом и трижды стерильной дистиллированной водой. Затем семена обрабатывали суспензией спор 106 КОЕ/мл в течение 2 ч, после чего семена высевали в 0.5 л стерильные банки, содержащие 100 г гранул вермикулита, смоченного 35 мл питательной среды MS (Murashige and Skoog, ICN Biomedicals, Нидерланды). Корни и листья недельных проростков рапса взвешивали и навески ~100 мг помещали в стерильные микропробирки объемом 2 мл между двумя стеклянными шариками диаметром 6 мм (нижний) и 7 мм (верхний). Добавляли 1 мл стерильной воды и гомогенизировали ткани растений с помощью аппарата FastPrep FP120 (Франция) в течение 45 с (скорость устанавливалась 5.5 колебаний в сек). Для определения титра полученные суспензии рассевали на питательный агар в чашки Петри. Опыт повторяли трижды.
Для изучения влияния обработки растений культурой B. subtilis ИМВ В-7023 на чувствительность растения к насекомым-вредителям семена рапса обрабатывали суспензией спор, как описано выше, после чего семена высевали в горшочки объемом 300 мл со стерильной почвой и выращивали на протяжении 2 нед. В один горшочек высе-
Таблица 2. Рост и накопление PO4 Bacillus subtilis ИМВ В-7023 при инкубации в средах с труднорастворимыми органическими и неорганическими соединениями фосфора*
Среда Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ в 1 мл 3 Накопление PO4 , мг/л рН
исходное, х105 конечное, х108 исходный конечный
С глицеро-фосфатом 1.2 ± 0.1 2.9 ± 0.3 280.0 7.0 5.6
4.1 ± 0.1 3.8 ± 0.2 300.0 7.0 5.5
С фитином 2.7 ± 0.5 0.8 ± 0.1 46.0 7.0 6.2
3.0 ± 0.2 0.8 ± 0.05 61.0 7.0 6.1
С Ca3(PO4)2 1.6 ± 0.1 1.8 ± 0.03 128.0 7.1 5.2
1.8 ± 0.1 2.1 ± 0.1 150.0 7.1 5.1
* Бактерии культивировали в течение 3 сут.
вали 9 семян. Затем такой же суспензией спор у половины растений с помощью ватного тампона обрабатывали листья. Контролем служили растения, семена которых были обработаны ватным тампоном, смоченным в стерильной воде. Опытные и контрольные растения выставляли в поле, пораженное блошками крестоцветных (Phyllotre-ta sp). Опыт проводили в первых числах июня, когда у этих насекомых наблюдается наибольшая активность. Через 2 и 4 дня визуально подсчитывали число укусов на одно растение.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По фенотипическим признакам штамм ИМВ В-7023 был отнесен к виду группы Bacillus subtilis. Из литературы известно, что вид Bacillus subtilis представляет соб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.