СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Liu B. P., Strittmatter S. M. Curr. Opin. Cell Biol. 2001, 13, 619-625.
2. Kumanogoh A., Suzuki K., Ch'ng E., Watanabe C., Marukawa S., et al. J. Immunol. 2002, 169, 1175-1181.
3. Wang X., Kumanogoh A., Watanabe C., Shi W., Yoshida K., Kikutani H. Blood 2001, 97, 3498-3504.
4. Куклина Е. М., Байдина Т. В., Данченко И. Ю., Некрасова И. В. БЭБиМ. 2014, 157, 198-201.
5. Shi W., Kumanogoh A., Watanabe C., Uchida J., Wang X., et al. Immunity. 2000, 13, 633-642.
6. Kikutani H., Kumanogoh A. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 159-167.
7. Giraudon P., Vincent P., Vuaillat C., Verlaeten O., Cartier L et al. J. Immunol. 2004, 172, 1246-1255.
THE LEVEL OF SOLUBLE SEMA4D IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS Kuklina E. M., Nekrasova I. V., Baidina T. V.1, Danchenko I. Yu.2, Lopatina V. A.
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms the Ural Branch of the Russian; 'Perm State
Medical Academy named after Academician E. A. Vagnera Russian Ministry of Health, Perm, Russia
The level of soluble semaphorin Sema4D in serum, as well as in culture of intact and activated T lymphocytes in multiple sclerosis patients have been studied, and comparing the results with membrane semaphorin expression by T cells was carried out. The increasing of serum Sema4D level in multiple sclerosis has been revealed, the effect being most prominent in patient with exacerbation, as well as the significant augmentation of their formation in 18-hour lymphocyte culture. The data obtained are in line with our previous results on the membrane semaphorin expression by T lymphocytes of multiple sclerosis patients. Taking into account the ability of Sema4D to induce in model system in vitro the apoptosis of immature neurons and oligoden-drocytes, the data obtained implicate possible semaphorin contribution to multiple sclerosis development.
Key words: emaphorins, sSema4D, T-lymphocytes, multiple sclerosis, autoimmunity
БИОМАРКЕРЫ АКТИВНОСТИ ТИМУСА ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ И АТЕРОСКЛЕРОЗЕ
Лахонина Н. С., Головизнин М. В., Никонова М. Ф.1, Донецкова А. Д.1, Булдакова Ю. Р., Тимофеев В. Т.2
ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова, 'ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России;
2ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Москва, Россия
У больных ревматоидным артритом (РА), различными формами ИБС и здоровых лиц разного возраста проводилось исследование колец реаранжировки альфа-цепи Т-кле-точного рецептора (TREC) и фенотипа лимфоцитов с помощью проточной цитометрии, в том числе с применением метода магнитной сепарации с целью выявления признаком генотипической и фенотипической незрелости и определения количества клеток, несущих маркеры ранних тимических эмигрантов (РТЭ). В ходе исследования были выявлены отрицательная корреляция между уровнем TREC у доноров и больных инфарктом миокарда, у больных ревматоидным артритом подобной взаимосвязи не выявлено, что может говорить об изменении динамики тимической активности при данном заболевании. При исследовании фенотипа у больных было выявлено увеличение содержания клеток СБ34+ при высокой степени активности заболевания и внесуставных проявлениях. Метод магнитной сепарации лимфоцитов может быть использован для получения обогащенной суспензии клеток СБ4+ и дальнейшего изучения субпопуляции РТЭ.
Ключевые слова: ревматоидный артрит, Т-лимфоциты, TREC, нарушение созревания
Известно, что дисбаланс субпопуляций в инициации развития ревматоидного артри-зрелых Т-лимфоцитов играет важную роль та (РА) [1], однако в литературе встречаются
данные о выявлении в синовиальной оболочке у больных РА Т-лимфоцитов с атипичным «незрелым» фенотипом, несущих маркеры активации [2]. Кроме РА при системной красной волчанке (СКВ) также выявлены клетки с фенотипическими признаками незрелости, активно продуцирующие провоспалительные цитокины [3, 4]. Таким образом, изучение нарушения созревания Т-лимфоцитов может представлять интерес для углубленного понимания механизмов развития системных аутоиммунных болезней (АИЗ). Говоря о созревании и селекции Т-лимфоцитов, невозможно обойти стороной роль тимуса как центрального органа иммунитета. В последнее время появились методы, позволяющие получить информацию о функциональной активности тимуса, в частности, исследование колец реаранжировки а-цепи Т-клеточного рецептора (TREC), которые являются генетическими маркерами ранних тимических эмигрантов (РТЭ). Этот метод исследования активно применяется у больных с ВИЧ-инфекцией [5], а также при АИЗ, таких как СКВ и РА. Изучение уровня TREC, количественного содержания РТЭ, которые являются предшественниками регуляторных клеток T-reg и, возможно, Th17 позволит прояснить роль патологии Т-клеточной селекции в развитии системного аутоиммунитета. Учитывая активную разработку генно-инженерных биологических препаратов, воздействующих точечно на цитокины, их рецепторы или другие биомолекулы, незрелые лимфоциты могут стать потенциальной мишенью биопрепаратов. С другой стороны, учитывая роль Т-, В-клеток и аутоиммунных реакций в развитии атеросклероза изучение Т-клеточного созревания у больных с клинически значимым атеросклерозом также представляет научный интерес.
Целью исследования было изучение особенностей фенотипа лимфоцитов периферической крови у больных РА и различными формами ишемической болезни сердца, оценка уровня TREC, определение клинического значения Т-клеточных субпопуляций с атипичным фенотипом, изучение уровня маркеров РТЭ у обследуемых лиц.
Задачи исследования:
1. Изучить рецепторный аппарат лимфоцитов и основные Т-клеточные субпопуляции у доноров, больных РА и ИБС с целью выявления признаков фенотипической незрелости;
2. Изучить содержание колец реаранжиров-ки а-цепи Т-клеточного рецептора как генетического маркера ранних эмигрантов из тимуса у доноров, больных РА и ИБС;
3. Изучить возможности применения метода магнитной сепарации Т-лимфоцитарных субпопуляций для оценки их фенотипической незрелости.
Материал и методы. Было обследовано 56 больных РА (средний возраст 55,5±10,89 лет), из них 42 с серопозитивным и 14 с серонега-тивным РА, 23 больных с высокой и 33 со средней степенью активности по критериям DAS28, 28 больных ОИМ (средний возраст 68,0±10,04 лет), 13 больных хроническими формами ИБС (средний возраст 68,0±9,06 лет), и 39 здоровых доноров в возрасте от 16 до 68 лет. Помимо обычного клинико-лабораторного обследования, проводилось выделение лимфоцитов периферической крови с последующим исследованием их фенотипа методом проточной ци-тофлоуметрии с помощью меченных монокло-нальных антител к маркерам CD3, CD4, CD8, HLA-DR, и определение уровня TREC методом ПЦР, а также был использован метод магнитной сепарации лимфоцитарных субпопуляций.
Результаты. Исследование фенотипа лимфоцитов было выполнено у 45 больных РА, в том числе у 21 с высокой и 24 со средней степенью активности по DAS28. По сравнению с донорами у больных РА было выявлено достоверное (р<0,05) снижение уровня клеток CD3+8+ (10,83±7,9 У5 21,75±9,05). При исследовании уровня CD3+4+ лимфоцитов различий между больными РА, ИБС и донорами получено не было. При сравнении групп с высокой и средней степенью активности по DAS28 отмечалось увеличение количества атипичных клеток CD3-4+, несущих маркер Т-хелперов, но лишенных основного маркера Т-лимфоцитов, у больных с высокой активностью (1,17±1,98% У5 0,49±0,75%, р<0,05). У больных с гипотрофией мышц было выявлено увеличение содержания CD3-4+ и уменьшение содержания CD4+8+ лимфоцитов (1,03± 1,71% и 0,02±0,06 по сравнению с 0,33±0,37% и 0,89±1,2% соответственно). У больных с анемией также наблюдался более высокий уровень CD3-4+ (1,71±2,41 и 0,41±0,49 соответственно, р<0,05). У пациентов с вторичным синдромом Шегрена отмечалось повышение экспрессии HLADR, характеризующего активацию лимфоцитов (16,5±3,1 при
наличии синдрома Шегрена и 9,17±4,59 в его отсутствие, p<0,005).
При исследовании уровней TREC у взрослых было выявлено снижение их в зависимости от возраста, наблюдавшееся как у доноров, так и у больных. В группе доноров в возрасте старше 45 лет (9 человек) медиана TREC составила 0,051858, у доноров в возрасте 30-45 лет (8 человек) - 0,08782. В группе пациентов со стабильной стенокардией - 0,00032. У больных инфарктом миокарда медиана TREC составила 0,00167. У больных РА (возраст 40,4±2,8 лет, 12 человек) - 0,00766, у больных РА в возрасте 57,5±1,3 года (16 человек) - 0,00065. Статистически достоверные различия были получены между группами доноров 30-45 лет и больными ИБС и РА старшей возрастной группы. В группах доноров и больных ОИМ была выявлена средней силы отрицательная достоверная корреляция между уровнем TREC и возрастом обследуемых. Так, в группе доноров коэффициент корреляции составил -0,420530 (p=0,007684), в группе больных ОИМ -0,522697 (p=0,005155). В отличие от них, в группе больных ревматоидным артритом корреляция была слабой и недостоверной (R= -0,254572, p=0,200039). При анализе взаимосвязи между длительностью ревматоидного артрита и уровнем колец реаранжировки была выявлена тенденция к увеличению числа TREC, однако достоверной корреляции мы не получили (R=0,348081, p=0,122044). Эти данные позволяют предполагать, что у больных ревматоидным артритом происходят изменения в работе тимуса, отражающиеся в изменении уровне TREC.
В ходе выполнения работы мы использовали различные методы магнитной сепарации - с использованием магнитных частиц (бус), меченных антителами к CD3 для последующей работы с CD3-негативными клетками, а также 2 вида наборов для работы с CD4 положительными клетками. В одном варианте методики бусы сначала присоединялись к CD4-позитивным клеткам, а после разделения клеточной суспензии на CD4+ и CD4- они отделялись от клеток с помощью специального раствора, позволяя дальше исследовать фенотип CD4+ клеток. Однако более перспективной мы сочли другую методику, в которой используется смесь антител к тем антигенам, которые отсутствуют на CD4-позитивных клетках (CD8, 19 и т.д.). При этом с помощью магнита удаляются «ненужные» клетки,
а CD4-позитивные клетки остаются вне контакта с магнитными частица
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.