ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 3, с. 334-339
УДК 582.282.123.2:547
БИОСИНТЕЗ ФУМИХИНАЗОЛИНОВ ГРИБОМ Pénicillium thymicola © 2012 г. В. П. Желифонова, Т. В. Антипова, А. Г. Козловский
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290; e-mail: K0zl0vski@ibpm.pushchin0.ru Поступила в редакцию 3.10.2011 г.
Биосинтез фумихиназолинов F и G (ФХ), РС-2 и пигментов грибом P. thymicola ВКМ FW-869 напрямую зависит от количества углеродного субстрата (маннит) в среде. При всех изученных концентрациях маннита преобладала продукция пигментов. Условием преимущественного биосинтеза ФХ грибом P. thymicola является лимитирование источником углерода (маннитом) и присутствие NaCl в среде культивирования гриба. NaCl оказывает регуляторное влияние на образование вторичных метаболитов, увеличивая биосинтез ФХ и снижая образование пигментов. Максимальные показатели биосинтеза ФХ и подавление продукции пигментов достигнуты при концентрации маннита в среде 20 г/л и 2.5% NaCl.
Мицелиальные грибы являются продуцентами биоактивных вторичных метаболитов, относящихся как к микотоксинам, так и к метаболитам, обладающих важными терапевтическими свойствами, которые нашли применение в медицине. К ним относятся хиназолиновые алкалоиды, встречающиеся у грибов родов Aspergillus, Penicillium, Acremoni-um, Neosartorya. Для хиназолиновых соединений в зависимости от заместителей показан разнообразный биологический эффект: болеутоляющий, противовоспалительный, антимикробный, брон-холитический, седативный, противоопухолевый и др. [1]. Представителями хиназолиновых алкалоидов являются фумихиназолины А-G, образующиеся из антраниловой кислоты, триптофана и алани-на. Их продуцируют некоторые штаммы грибов Aspergillus fumigatus и Penicillium thymicola [2, 3]. Фумихиназолины F и G обладают противораковой активностью на клетки лимфолейкоза P 388 (ED50 13.5 мкг/мл и 13.8 мкг/мл соответственно) [2].
Ранее у штамма P. thymicola ВКМ FW-869, выделенного из образца криопэга возрастом 100— 120 тыс. лет, были идентифицированы фумихина-золины F и G (ФХ) и метаболит поликетидной природы PC-2 (6-(1-гидроксипентил)-4-меток-сипиранон) [4].
Цель работы — изучение влияния различных факторов на биосинтез фумихиназолинов F и G грибом P. thymicola ВКМ FW-869 и выявление условий, оптимальных для продуцирования этих метаболитов.
МЕТОДИКА
Использовали штамм P. thymicola ВКМ FW-869 из Всероссийской коллекции микроорганизмов
ИБФМ РАН (ВКМ). Гриб выращивали глубинным способом в 150 мл минеральной среды в колбах объемом 750 мл при 24 ± 1°C на качалке (220 об/мин). Постоянными компонентами сред были (г/л): янтарная кислота — 5.4, MgSO4 • 7H2O — 0.3, KH2PO4 — 1.0, рН доводили до 5.4 концентрированным раствором NH4OH. Влияние концентрации маннита на продукцию вторичных метаболитов изучали при концентрации субстрата 10, 20, 30, 40 или 50 г/л. Поверхностное культивирование гриба и влияние ионов цинка (4.4 мг/л ZnSO4 • 7Н2О) проводили на среде с 50 г/л маннита. Влияние 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 4.0 и 5.0% NaCl на рост и биосинтез вторичных метаболитов изучали при концентрации маннита 20 г/л. Дрожжевой экстракт ("Difco", США) (0.1 г/л), KCl (0.5 г/л), повышенное количество янтарной кислоты (10.8 г/л) и ионов аммония вносили в среду с 20 г/л маннита и 2.5% NaCl. Влияние глюкозы, маннита, ксилозы, арабинозы, сахарозы, глицерина и этанола (8 г углерода на 1 л среды) на рост и продукцию вторичных метаболитов изучали в среде (г/л): (NH4)2SO4 - 3.0, KH2PO4 - 1.0, K2HPO4 - 0.1, MgSO4 • 7H2O - 0.7. Этанол вносили дробно ежесуточно (3 об. %). Засев сред осуществляли водной суспензией конидий (1-2 х 107 спор/мл) 14-суточной культуры, выращенной на скошенном сусло-агаре. Рост штамма оценивали по сухой массе мицелия.
Метаболиты извлекали из фильтрата культу-ральной жидкости экстракцией хлороформом, а из мицелия - экстракцией метанолом. Метаноль-ную вытяжку разбавляли дистиллированной H2O в соотношении 1 : 10 и экстрагировали хлороформом. Хлороформные экстракты высушивали над Na2SO4 (безводный) и упаривали в вакууме. Ана-
Таблица 1. Содержание внутриклеточных и внеклеточных ФХ (мг/л) при глубинном и поверхностном культивировании P. thymicola на минеральной среде с 50 г/л маннита
Культивирование Возраст мицелия, сут Биомасса, г/л Внутриклеточные Внеклеточные Суммарные
мг/л q6, мг/г сут мг/л qэ, мг/г сут мг/л q, мг/г сут
Глубинное 6 1.2 1.3 0.2 11 1.5 12.3 1.7
10 1.8 6.5 0.7 40 4.0 46.5 4.7
13 3.9 13 0.6 97 4.9 110 5.5
Поверхност- 10 1.6 8.3 0.5 33 2.1 41.3 2.6
ное 17 4.8 18 0.3 50 0.5 68.0 0.8
лиз экстрактов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках силикаге-ля (Silica gel 60 F254, "Merck", Германия) в системах: хлороформ—метанол—25%-ный NH4OH (конц.) (90 : 10 : 0.1 ) (I) и (80 : 20 : 0.2) (II). Вещества обнаруживали по поглощению в УФ-свете и после опрыскивания пластин реактивами Эрлиха для обнаружения индолсодержащих и Драген-дорфа для идентификации азотсодержащих метаболитов.
Концентрацию метаболитов определяли спек-трофотометрически (Specord UV VIS, "Carl-Zeiss Jena", Германия): желтый пигмент (П-1) при 460 нм в смеси (1 : 1) фильтрата культуральной жидкости и карбонатного буфера (pH 10.3), желто-коричневых пигментов (П-2) при 365 нм в фильтрате культуральной жидкости. Концентрацию ФХ и PC-2 определяли после их выделения из хлороформного осадка с помощью препаративной ТСХ, в метаноле при 285 и 280 нм соответственно. Расчет производили, используя соответствующие калибровочные кривые.
Тоничность или осмоляльность сред (m0) рассчитывали по формулам m0 = —128 log aw; aw = N/(n + + N); где aw — активность воды, N— моли воды в растворе, n — моли растворенных веществ; для электролитов — вместо n подставляли vn, где v — число ионов на молекулу [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что накопление вторичных метаболитов в среде культивирования связано с процессами их экскреции из клеток и определяется прежде всего физико-химическими свойствами соединений, местом их биосинтеза и способом их выделения из клеток организмом-продуцентом. Ранее ФХ выделяли из мицелия Aspergillus fumiga-tus и P. thymicola, выращенных поверхностным способом на комплексных средах [2, 3, 6]. Нами было проведено изучение распределения ФХ между мицелием и культуральной жидкостью при глубинном и поверхностном культивировании штамма FW-869 на минеральной среде (маннит
50 г/л). У гриба, независимо от способа культивирования, основная часть ФХ от их общего количества находилась в культуральной жидкости (табл. 1). Так, при глубинном культивировании содержание внутриклеточных ФХ составило 12— 14%, а при поверхностном культивировании — 25—35% от суммы ФХ. Причем при глубинном культивировании удельные скорости биосинтеза (^б) и экскреции (#э) ФХ были выше на 30 и 57% соответственно по сравнению с поверхностным ростом. Сравнение этих результатов с данными литературы [3] показало практически аналогичные значения для внутриклеточного содержания ФХ — 13 и 9 мг/л соответственно. Таким образом, наши результаты однозначно свидетельствовали, что наиболее эффективным является глубинное культивирование с последующим выделением ФХ из фильтрата культуральной жидкости.
Было обнаружено, что в процессе роста гриба Р. thymicola в различных средах происходило окрашивание культуральной жидкости сначала в ярко-желтый, затем в насыщенный желто-коричневый цвет. Анализ экстрактов методом ТСХ показал присутствие одного желтого пигмента ^0.7 (I)) и двух желто-коричневых пигментов ^г0.62 и 0.66 (I)). Все эти вещества не давали положительной реакции с реактивом Драгендорфа, что свидетельствовало об отсутствии азота в структуре соединений. УФ-спектр желтого пигмента (П-1) имел ^макс в областях 224, 302, 461 нм, а спектры желто-коричневых пигментов (П-2) были идентичны при 208, 274, 368, 446 нм. Близкие значения хро-матографической подвижности желто-коричневых пигментов и одинаковый хромофор, указывает на то, что данные соединения имеют сходную структуру. Для пенициллов известен биосинтез пигментов разнообразной структуры, синтезирующихся из ацетил- и малонил-КоА по полике-тидному пути [7].
Известно, что биосинтезу индолсодержащих метаболитов различной структуры способствуют среды, содержащие два источника углерода — кислоту цикла Кребса и медленно утилизируемый углевод, например янтарную кислоту и ман-
г/л; П-2 х 100 мг/л 7
ФХ, РС-2, мг/л 150
- 100
50
3
5
7
9
11
13 сут
Рис. 1. Динамика роста и биосинтеза вторичных метаболитов при культивировании P. thymicola в среде с 50 г/л маннита:
1 - биомасса, г/л; 2 - ФХ, мг/л; 3 - РС-2, мг/л; 4 - П-2, мг/л.
нит [8]. Было изучено влияние различных концентраций маннита при постоянной концентрации других компонентов среды на рост и биосинтез метаболитов P. thymicola. Следует отметить, что ман-нит рассматривался не только как углеродный субстрат, но и как осмопротектор, так как тонич-ность сред изменялась от 0.28 до 0.50 осмолей. Рост гриба характеризовался диауксией, что свидетельствовало о последовательной утилизации углеродных субстратов (рис. 1). Влияние концентрации маннита на максимальные показатели роста и биосинтеза метаболитов P. thymicola представлены в табл. 2. Можно видеть, что биомасса возрастала до концентрации 30 г/л маннита в среде, а затем оставалась постоянной. Максималь-
ные значения удельной скорости роста гриба на сукцинате (ц1) увеличивались до концентрации 40 г/л маннита, а далее не менялись, что свидетельствовало о влиянии тоничности среды на ц1. Оптимальная тоничность среды для роста на сукцинате была выше 0.45 осмолей. Максимальная удельная скорость роста на манните (ц2) возрастала до концентрации 30 г/л маннита в среде. Дальнейшее увеличение маннита не влияло на содержание биомассы, но приводило к снижению ц2 в 1.5 раза по сравнению с максимальным значением. Эти данные свидетельствуют о том, что маннит до концентрации 30 г/л является лимитирующим рост субстратом, а дальнейшее увеличение его концентрации в среде приводит к переключению на другой лимитирующий компонент среды. Для подтвержден
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.