ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 3, с. 292-296
УДК 577.123:577.15:612.014.43
БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ Polyscias filicifolia ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
© 2009 г. Н. В. Кириллова, Ä. И. Спасенков, О. М. Спасенкова, М. Ä. Стрелкова
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, 197376 Санкт-Петербург;
e-mail: biochem@spcpa.ru Поступила в редакцию 24.10.2007 г.
Установлено, что при воздействии теплового шока (3 ч при 45°С) в клетках культуры полисциас Polyscias filicifolia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae) содержание нуклеиновых кислот достоверно снижалось (до 20-30%). Понижение концентрации ДНК и РНК в клетках было более значительным (до 30-40%), если воздействие температуры на культуру ткани увеличивали до 24 ч. Низкие положительные температуры (24 ч при 7°С) вызывали еще более резкое снижение концентрации ДНК (на 34.2%) и общего пула РНК (на 48%). Присутствие пероксида водорода и феназина метасульфата в среде культивирования приводило к дозозависимому и разнонаправленному воздействию на клеточную пролиферацию по критерию биосинтеза ДНК.
Активные формы кислорода (АФК) являются естественными компонентами любой аэробной клетки, они постоянно образуются при метаболизме кислорода, а также в ходе многих ферментативных процессов. Широкий спектр повреждающего действия АФК обусловлен их выраженной способностью атаковать и окислять разнообразные биомолекулы, важнейшими из которых являются нуклеиновые кислоты, белки, липиды и углеводы [1, 2]. В последние годы высказывается мнение о том, что механизмы, связанные с повреждающим действием АФК, эволюционно закреплены. Были найдены гены, имеющие отношение к регуляции редокс-состо-яния клетки, балансу генераторов кислородных радикалов и антиоксидантных защитных механизмов [3, 4]. В то же время известно, что любые биотические и абиотические стрессы приводят к кратковременной генерации АФК и сопровождаются развитием окислительного стресса в клетках. Данные процессы являются частью сигнального каскада, ведущего к развитию антистрессовых защитных механизмов в этих клетках, необходимых для адаптации живых организмов к неблагоприятным условиям внешней среды [2]. Полагают, что АФК могут действовать как классические сигнальные молекулы в регуляции различных клеточных процессов. Так, АфК играют значительную роль в обеспечении нормальной физиологической активности клеток, в частности, могут выступать в качестве вторичных внутриклеточных посредников, участвовать в синтезе ряда биологически активных метаболитов, являться активаторами митогенеза, клеточной пролиферации, дифференциации и эмбриогенеза [2, 3, 5-7].
Цель работы - изучение влияния in vitro окислительного стресса на содержание ДНК в клетках культуры ткани Polyscias filicifolia для оценки воз-
действия АФК на митотическую активность клеток.
МЕТОДИКА
Объектом работы служила культура ткани полисциас Polyscias filicifolia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae) в процессе ее длительного культивирования на модифицированной среде Мурасиге и Скуга [8]. Биомассу штамма, находящегося в постоянной коллекции Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, выращивали в темноте при температуре 26 ± 1°С и относительной влажности воздуха 70% с циклом культивирования 30-35 сут, после чего разрыхленную ткань (=5 г) переносили на 50 мл свежей питательной среды. Для проведения исследований использовали биомассу из 5-6 пассажей 20-суточного возраста.
Навески ткани гомогенизировали в ступке на холоду с 0.05 М фосфатным буфером, рН 7.8, в соотношении 0.5 мл буфера/1 г сырой массы ткани в присутствии 0.05 мл 3%-ного тритона X-100. Полученный гомогенат оставляли в течение 30 мин при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 12000 g. Осадок отбрасывали, а в супернатанте определяли спектрофотометрическим методом активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1), в качестве субстрата использовали кверцетин [9], и каталазы (КФ 1.11.1.6) - перманганатометрическим методом с некоторыми модификациями, обусловленными особенностями ее ферментативной кинетики [10]. Спектрофотометрическое количественное определение РНК и ДНК проводили по методикам, описанным ранее [11, 12]. Непременным условием данного метода является удаление пиг-
мг/г 0.12 г
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02
0 1 3 5 7 10 14 17 20 23 27 30 35 40
сут
Рис. 1. Содержание РНК (1) и ДНК (2) в процессе роста клеток РоЪуяаая /ШЫ/оИа.
% от контроля 120 г
100 80 60 40 20 0
-Г
2 3 РНК
2 3 ДНК
Рис. 2. Влияние температурного шока на пролиферацию клеток Polyscias filicifolia. 1 - контроль; 2 - тепловой шок (3 ч при 45°С); 3 - тепловой шок (24 ч при 45°С); 4 - холодовой шок (24 ч при 7°С).
ментов, а также кислоторастворимого и липидного фосфора.
Культуру ткани полисциас 20-суточного возраста подвергали высоко- (3 и 24 ч при 45°С) и низкотемпературной (24 ч при 7°С) обработке, что составляло ±19°С по сравнению со стандартной температурой культивирования. Выбранные температурные режимы широко используются в настоящее время при изучении влияния температурных стрессов на растительные ткани [3, 13, 14].
Пероксид водорода в концентрациях от 10 до 500 мкмоль или стерильные растворы феназина ме-тасульфата в концентрации от 2 до 16 мкмоль вносили в асептических условиях в каллусы 20-суточного возраста. Через 24 ч после инкубирования культуры в стандартных условиях выращивания оценивали уровень пролиферации ткани, рассчитанный по изменению содержания ДНК в клетках по сравнению с контрольными образцами, в которых содержание нуклеиновой кислоты принимали за 100%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Учитывая ведущую роль нуклеиновых кислот в жизнедеятельности живых организмов, была проведена сравнительная оценка содержания ДНК и суммарного пула РНК в клетках культуры ткани полисциас. По-видимому, высокий уровень содержания ДНК, установленный после 20 сут роста культуры, связан с повышением митотической активности клеток in vitro, находящихся в экспоненциальной фазе роста и характеризующейся ростом с ускорением (рис. 1). При анализе полученных данных было выявлено закономерное соответствие между фазными изменениями в содержании белка, которое было определено нами ранее [15], и РНК в культивируемых клетках, в частности, на 5, 14-15,
27 и 30-35 сут роста биомассы ткани. Некоторое понижение содержания ДНК на последних этапах культивирования клеток, по-видимому, связано с повышением в них активности ДНКаз. Другими авторами на модели каллуса табака (Nicotiana tobaccum) [16] было показано, что снижение содержания ДНК в клетках при старении тканей соответствовало повышению активности ДНКаз.
Среди механизмов адаптации растений к неблагоприятным условиям среды особое место занимают ответные реакции растительных клеток на температурный стресс. В ответ на резкое колебание температуры окружающей среды происходят значительные изменения на уровне генома и метаболизма белка [17]. Эксперименты in vitro по воздействию высоких и низких положительных температур на пролиферативную активность клеток культуры полисциас выявили, что воздействие теплового шока (3 ч при 45°С) приводило к достоверному уменьшению содержания ДНК и РНК по сравнению с контролем. При удлинении срока воздействия высокой температуры до 24 ч наблюдали дальнейшее снижение концентрации нуклеиновых кислот, а воздействие низких положительных температур (24 ч при 7°С) приводило к еще более резкому падению концентрации ДНК на 34.2% и РНК - 48%. Данные представлены на рис. 2.
Известно, что абиотические стрессы, в том числе и температура, в животных и растительных клетках приводят к генерации АФК, особенно пероксида водорода [3, 13, 14]. Прямое доказательство взаимосвязи между окислительным и тепловым стрессом было получено при использовании комбинированного светового и теплового шоков [3, 18]. Кроме того, было показано, что тепловой шок может приводить к аккумуляции пероксида водорода в растениях и в темноте [14]. В ряде работ было также установлено, что уже через несколько минут после
4
1
4
ДНК, % от контроля (a)
120 100 80 60 40 20 0
0 5 0 20 50 100 500
мкмоль
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
02
(б) д:
8 10 12 16
мкмоль
Рис. 3. Влияние пероксида водорода (а) и феназина метасульфата (б) на биосинтез ДНК в клетках Polyscias filicifolia.
4
воздействия низких температур в темноте на проростки различных растений уровень пероксида водорода в клетках повышался в 3 и более раз [19]. Избыточное количество АФК может легко взаимодействовать с биомолекулами клеток, нарушать их структуру и функции и вызывать множественные первичные нарушения в живых системах. Как известно, при окислительном повреждении ДНК происходит остановка деления клеток [5], что, по-видимому, и наблюдалось в проведенных нами экспериментах по длительному влиянию неблагоприятных температур на клеточную пролиферацию (рис. 2). Кроме того, некоторые авторы полагают, что в условиях окислительного сдвига в клетках происходит активация ряда факторов транскрипции, поэтому активированная клетка, вступившая в клеточный цикл, может подвергаться не пролиферации, а апоптозу [2, 4, 20].
В данной работе нами было также установлено, что степень повреждения ДНК и РНК зависела от вида температурного шока (низкие температуры оказывали более повреждающее действие) и длительности воздействия повреждающего фактора (3 и 24 ч при 45°С).
Долгое время в литературе доминировало мнение, что АФК действуют лишь как разрушители и не выполняют никаких регуляторных функций в организме. Однако в настоящее время биологическое значение окислительного стресса является у биохимиков предметом острой дискуссии. Так, в последние годы было установлено, что добавление пероксида водорода в среду культивирования может стимулировать in vitro пролиферацию различных клеток млекопитающих, т.е. АФК могут действовать, как классические сигнальные молекулы во многих клеточных процессах [2, 6, 19].
В связи с этим в данной работе были поставлены эксперименты по изучению влияния in vitro АФК на пролиферацию культивируемых растител
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.