ЦИТОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ^
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
БЛОКИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАСОМ НАРУШАЕТ РИТМ СИНТЕЗА БЕЛКА - МАРКЕРА ПРЯМЫХ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
© 2015 г. В. Я. Бродский, Н. П. Шарова, Л. А. Мальченко, Д. С. Конченко*, Т. К. Дубовая*, Н. Д. Звездина
Институт биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова 119334, Москва, ул. Вавилова 26 * Российский национальный исследовательский медицинский университет 117997, Москва, ул. Островитянова 1 E-mail: brodsky.idb@bk.ru Поступила в редакцию 18.07.2014 г.
Окончательный вариант получен 21.08.2014 г.
Исследовано влияние торможения активности протеасом на прямые межклеточные взаимодействия в первичных культурах гепатоцитов. Маркер межклеточных коммуникаций — околочасовой ритм синтеза белка. Введение ингибитора протеасом MG132 в дозах 10 или 20 мкМ в среду с культурами гепатоцитов на 19 час приводит к значительному снижению суммарного пула 3Н-лейцина в клетках. Включение лейцина в белки изменяется мало или не изменяется, падает содержание свободного меченого лейцина в гепатоцитах. Искажается сравнительно с контролем ритм синтеза белка. Ритм восстанавливается внешними организаторами — ганглиозидами и мелатонином, а также при усилении активности протеинкиназ — ключевого фактора организации ритма синтеза белка. Кратковременное 3-ч действие MG132 не изменяет пул лейцина, но ритм синтеза белка также нарушается. Таким образом, катаболизм белков влияет на межклеточные взаимодействия, организующие ритм синтеза белка. Другой фактор негативного контроля ритма синтеза белка — секреция белков из гепатоцитов, показанная in vivo во многих исследованиях, выявлена и в нашей работе при измерениях белков, окрашенных кумасси бриллиантовым синим G250 в среде с культурами гепатоцитов.
Ключевые слова: межклеточные взаимодействия, протеасомы, ингибитор MG132, околочасовые ритмы, ритм синтеза белка, секреция белков, гепатоциты, кумасси G250.
DOI: 10.7868/S047514501501005X
ВВЕДЕНИЕ
Ритм синтеза белка — один из метаболических околочасовых ритмов (Бродский, 2014). Такие ритмы в клеточных культурах организуются прямыми межклеточными взаимодействиями, и поэтому околочасовой ритм синтеза белка используют как модель для изучения механизмов согласования активности клеток в онтогенезе и при патологии (см. также Brodsky, 2006). Характеризуя такую модель, уместно ответить на вопрос: почему непрерывный синтез белка с регулярным усилением накопления новообразованных белков не приводит к увеличению массы клеток? Как компенсируется синтез? Задачей настоящей работы явилось исследование способов удаления белков из клеток, по сути, негативного контроля ритма синтеза белка. Значимость модели обусловлена тем, что сходный механизм межклеточных коммуникаций определен и в клетках in vivo.
Основной объект наших исследований — гепатоциты — секретируют in vivo белки плазмы крови. В давней работе нашей лаборатории выявлены неравномерные изменения меченых лейцином новообразованных белков в культурах гепатоцитов крысы (Новикова и др., 1982). Продолжительность наблюдений была не более часа, неясны были изменения массы клеток. Настоящая работа дополняет эти исследования определением кинетики содержания белков в среде с культурами гепатоцитов, т.е. кинетики секреции. Впервые изучена возможность влияний катаболизма белков на ритм их синтеза, т.е. на межклеточные взаимодействия. Исследовали эффекты торможения активности протеасом. Ингибитор протеасом MG132 (z—leucyl—leucyl—leucynal) ранее использовали во многих работах как эффективный блокатор делений и стимулятор апоптоза в линиях трансформированных клеток (например, Ciechanover, 2010; Cusimano et al., 2010; Bra-
БЛОКИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАСОМ
45
vo-Cuellar et al., 2013). Изучали действие MG132 на опухолевые клетки в организме или в первичных культурах как потенциального противоракового средства (Kadl Clkova et al., 2004; Wente et al., 2005; Alexandrova et al., 2008). При введении MG132 в организм не учитывали возможные влияния ингибитора протеасом на нормальные интенсивно пролиферирующие ткани организма, например на костный мозг или эпителий кишечника. Не исследованы эффекты ингибирования активности протеасом на слабо делящиеся клетки, такие как гепатоциты, во многом определяющие жизнеспособность организма. Опубликованы лишь данные по формированию пула протеа-сом в онтогенезе печени (Шарова и др., 2006; Sharova et al., et al., 2009; Карпова и др., 2013). Влияния MG132 на метаболизм клеток и, в частности, на синтез белка, практически не изучены.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Гепатоциты изолировали из печени крыс Ви-стар весом около 300 г в возрасте 3—4 мес. Печень крысы перфузировали бескальциевым раствором Хенкса с 0.5 мМ ЕGТА и 0.05% раствором колла-геназы (Sigma, США) в среде 199, и получали суспензию гепатоцитов, содержащих около 90% жизнеспособных клеток. Суспензию разводили средой до концентрации около 106 клеток/мл и разливали в чашки Петри, на дне которых были стекла, покрытые коллагеном, и получали плотные культуры с близко расположенными клетками. Через 2 часа стекла с прикрепившимися клетками отмывали от неприкрепленных клеток и клеточных обломков и помещали в свежую среду 199, к которой были добавлены 0.2 мг/мл альбумина для клеточных культур (Sigma) и 0.5 мкг/ мл инсулина (Sigma); газовая фаза — 95% воздуха и 5% СО2. Через сутки культуры промывали, переносили в свежую среду и исследовали кинетику синтеза белка. Подробнее метод изоляции и культивирования гепатоцитов изложен ранее (Brodsky et al., 2000).
Интенсивность синтеза белка определяли по включению 3Н-лейцина в белки с поправкой на радиоактивность пула свободного лейцина в той же культуре. Пробы, по три культуры каждая, брали последовательно через 10 мин в течение 2 час. Каждую культуру инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°C в среде с 3Н-лейцином (25—30 мкО/мл, специфическая молярная активность 70—100 0/ммоль).Культуры промывали холодной средой и обрабатывали холодной (4°С) 5% хлорной кислотой в течение 50 мин. Затем культуры промывали этиловым спиртом, и клеточные белки растворяли гиамином (бензетониум гид-роксид, Sigma). Радиоактивность лейцина в белках и небелковой кислоторастворимой фракции,
т.е. свободного лейцина в клетках измеряли в каждой культуре отдельно, используя сцинтилля-ционный анализатор Perkin Elmer 2810TR. Относительное включение лейцина Icorr, характеризующее интенсивность синтеза белка, рассчитывали по формуле
Icorr = I,- х Pv/Pj (cpm),
где Ij — включение лейцина в белки за 10 мин, Pj — общая радиоактивность определенной культуры Pj = Ij + pj, где pj — радиоактивность пула свободного лейцина в той же культуре, а Pv — средняя радиоактивность культур определенного опыта (например, для 2-час опыта — 36 культур). Поскольку включение лейцина в белки и пул свободного лейцина измеряются в одной и той же культуре, в относительной величине Icorr вводится поправка на варьирующее число клеток в разных культурах. Как показали наши наблюдения, компенсируются также небольшие вариации температуры и рН среды в течение опыта (Brodsky et al., 2000). Каждый опыт ставили на культурах гепатоцитов одной крысы.
Для оценки значимости протеасом в организации ритма синтеза белка использовали ингибитор протеасом MG132 в дозах 10 или 20 мкМ (таблица). В среду с первичными плотными культурами гепатоцитов крысы после их прикрепления к стеклам, покрытым коллагеном, добавляли MG132 на 3 или на 19 час. Затем культуры отмывали, исследовали кинетику включения 3Н-лейцина в белки суточных культур, а также пул свободного (не включившегося в белки) лейцина и рассчитывали относительное включение Icorr, т.е. относительную скорость синтеза белка.
В исследовании кинетики секреции белков использовали суточные культуры гепатоцитов. Культуры отмывали и помещали в среду 199 без индикатора (фенолового красного) и без альбумина, но с инсулином (см. выше). Общий объем среды в чашке с культурами 50 мл. Объем каждой пробы — 125 мкл. Пробы брали через 10 мин в течение 2—3 час. Белки, выделенные гепатоцитами в среду, окрашивали кумасси бриллиантовым синим G250 (Bradford, 1976; Иванов, 1982). Для построения калибровочной кривой использовали от 1 до 10 мкг/мл альбумина в лунке стандартного планшета. В некоторые лунки добавляли 125 мкл чистой среды; эти точки принимали за 0. В последующие лунки добавляли альбумин, растворенный в культуральной среде. В каждую лунку со стандартом или секреторным продуктом добавляли 125 мкл реактива Бредфорда. Оптическую плотность окраски измеряли на фотометре Bеckman Coulter DTX 880 в области спектра 595 нм. Для расчета дифференциальных изменений интенсивности секреции в соседних парах проб вычитали из численного значения каждой последующей пробы значение предыдущей пробы.
3
Влияние ингибитора протеасом М0132 на включение 3Н-лейцина в белки плотных суточных культур гепатоци-тов крысы (I), пул свободного меченого лейцина в тех же культурах (Р) и относительное включение (1согг), характеризующее интенсивность синтеза белка
Номер М0132 час Вариант I Р I + Р Р/1 1согг
1 3 Контроль М0132 10 мкМ 54 51 592 479 646 530 11.0 9.4 69 ± 5 62 ± 3
2 Контроль М0132 10 мкМ 309 286 462 465 771 751 1.5 1.6 305 ± 12 292 ± 10
3 19 Контроль М0132 10 мкМ М0132 20 мкМ 152 151 149 645 267 271 797 418 420 4.0 1.8 1.8 206 ± 15 175 ± 17 183 ± 17
4 Контроль М0132 10 мкМ DMSO 2% 159 142 156 862 284 947 1021 426 1102 5.4 2.0 6.1 225 ± 22 211 ± 17 186 ± 15
5 Контроль М0132 10 мкМ + + ББО 0.3 мкМ 234 177 204 1546 417 571 1780 594 775 6.6 2.3 2.8 200 ± 27 236 ± 17 249 ± 23
6 Контроль М0132 10 мкМ 296 337 4012 116 4308 453 13.5 0.3 308 ± 50 333 ± 4
7 Контроль М0132 10 мкМ Мелатонин 5 нМ 121 99 111 1333 86 74 1454 185 185 11.0 0.9 0.7 165 ± 19 101 ± 3 112 ± 4
8 Контроль М0132 10 мкМ Мелатонин 50нм 189 229 206 4414 238 190 4603 467 396 23.3 1.0 0.9 206 ± 12 230 ± 18 210 ± 6
9 Контроль М0132 10 мкМ + + ФМА 1 мкМ 161 128 109 1763 78 67 1924 206 176 10.9 0.6 0.6 209 ± 21 126 ± 2 105 ± 3
ББО (стандартный препарат суммарных ганглиозидов из мозга быка) и ФМА (форбол миристат ацетат) вводили в среду отмытых
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.