РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 1, с. 108-116
^ КЛЕТОЧНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 612.6.03:612.014.482.3/4
БЛОКИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ 0- И у-ИЗЛУЧЕНИЕМ ОТ ИНКОРПОРИРОВАННЫХ И ВНЕШНИХ ИСТОЧНИКОВ. GrБЛОК, ИНДУЦИРОВАННЫЙ Р-ЧАСТИЦАМИ 3Н-ТИМИДИНА
И у-КВАНТАМИ 137Cs
© 2007 г. Н. Я. Гильяно *, Л. В. Коневега, С. И. Степанов, Е. Г. Семенова, Л. А. Носким
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Показано, что Р-частицы, испускаемые в низких дозах (0.12-0.46 Гр) при распаде 3Н-тимидина, инкорпорированного в ДНК эндотелиоцитов человека (линия ECV-304), индуцировали аккумуляцию клеток в 62-фазе клеточного цикла. Облучение клеток у-квантами 137Cs в дозах на порядок выше (1-6 Гр) было менее эффективным в индукции 02-блока. Кроме того, на клетках, облученных Р-ча-стицами, фиксировался довольно высокий уровень нестабильных хромосомных аберраций. Очевидно, что повреждения наследственных структур клетки в значительной степени и определяют блокирование прогрессии эндотелиоцитов в 62-фазе. Процент аберрантных анафаз (мосты и ацентрические фрагменты) при облучении в дозе 0.005 Гр был равен 25.3 ± 1.3%. Такой же уровень аберрантных анафаз наблюдается и при воздействии на эти клетки у-излучения 137Cs в дозе 1 Гр. Предполагается, что высокая генотоксичность Р-частиц обусловлена в первую очередь тем, что 3Н-тимидин инкорпорируется в ДНК клеток, и Р-частицы, испускаемые при распаде трития, возникают непосредственно в чувствительной мишени (ДНК), в отличие от того, как воздействуют у-кванты 137С при внешнем облучении.
Е^-304, клеточный цикл, 3Н-тимидин, 137Cs, 02-блок, хромосомные аберрации, радиометрия, проточная цитометрия.
Пролиферативной и миграционной способностью эндотелиальных клеток обусловлено формирование новых капилляров из предсуществую-щих кровеносных сосудов (ангиогенез). Ангиоге-нез является критическим событием для роста и метастазирования солидных опухолей. Опухолевый ангиогенез является прежде всего эндотели-альной дисфункцией. Эндотелий функционирует как селективный барьер между кровью и тканями и может генерировать эффекторные молекулы, которые регулируют тромбоз, воспаление, тонус сосудов и ремоделирование сосуда. Нарушение баланса между влиянием проангиогенных и анти-ангиогенных молекул ведет к патологическому ангиогенезу. Показано, что радиация увеличивает продукцию различных ангиогенных молекул, в частности эндостатина в опухоли [1].
Установлено, что ^-излучение прямо влияет на функцию эндотелиальных клеток, существенно снижая их способность к пролиферации и диффе-ренцировке [2]. Продемонстрирована эффективность у- и Р-источников в ингибировании образо-
*Адресат для корреспонденции: 188300 Гатчина, Ленинградская обл., ПИЯФ РАН; тел.: (813) 714-65-94; e-mail: giliano@omrb.pnpi.spb.ru.
вания неоинтима (рестенозиса) в поврежденных хирургическим вмешательством коронарных артериях [3-6]. Указанные источники нашли широкое применение при внутрикоронарной радиотерапии для ингибирования формирования неоинтима после повреждения артерий при ангиопластических операциях [7]. Как правило, они используются либо в виде меченных радионуклидами оснований, аминокислот либо меченых олигонуклеотидов [7-9]. Между тем известно, что эффективность радиационного воздействия зависит от положения источника излучения относительно чувствительной мишени - ДНК. Как при радиотерапии опухолей, так и при ингибировании рестенозиса она обеспечи-ает торможение пролиферации эндотелиоцитов.
В настоящей работе на модельной системе эндотелия сосудов человека в культуре мы исследовали влияние режимов облучения в различных дозах и положения источника в- и у-излучения на прогрессию эндотелиоцитов по клеточному циклу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Линия трансформированных эндотелиальных клеток человека ЕСУ-304 получена из коллекции
клеточного центра Института цитологии РАН. Эндотелиальные клетки культивировали во флаконах Карреля на среде Игла с добавлением 10% эмбриональной сыворотки. В качестве антибиотика использовали гентамицин.
Для радиометрической оценки пролиферации эндотелиальных клеток использовали (метил-3Н)-тимидин (ФГУП "Изотоп", Санкт-Петербург). Конечная концентрация изотопа в питательной среде составляла 0.066 МБк/мл.
Дозу от инкорпорированной компоненты 3Н-ти-мидина определяли из средней энергии (Еср) в-ча-стиц 3Н с энергией 5.7 КэВ (9.12 х 10-16 Дж), длины пробега в-частицы с такой энергией в водной среде, равной 0.5-0.7 мкм и диаметра клетки. Поскольку длина пробега гораздо меньше диаметра клетки млекопитающих, предполагается, что вся энергия в-частицы передается клетке, в ядре которой произошел распад 3Н. Масса эндотелиоци-та (т) принималась равной 1012 кг. В этом случае средняя поглощенная доза на одну клетку от одного 3Н распада будет равна ftH = Еср/т =
= 0.91 мГр. С помощью радиометрических измерений определяли количество распадов в клетке (N) за определенный период времени (t). Конечная доза D равнялась AH х N, где N определялась
экспериментально и зависела от удельной радиоактивности среды, а время было равно 21 ч.
Для обеспечения спектрометрических измерений в ходе проточно-цитометрического анализа клеточной пролиферации использовали бромистый этидий фирмы "Sigma".
Радиометрический анализ клеточной суспензии проводили на счетчике "Betaman 1206" фирмы "LKB" (Швеция). Пробы ДНК из лизирован-ных клеток (~104 на пробу) переводили на нитро-целлюлозные фильтры. После высушивания фильтры помещали в толуольный сцинтилляци-онный раствор и подвергали радиометрии.
Цитофлуорометрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили на проточном цитометре, созданном в группе радиобиологии и медицины [10]. Клеткам, посеянным на флаконах Карреля на среде Игла, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, через сутки среду заменяли на безсывороточную. В питательной среде без сыворотки клетки инкубировали в течение 18-48 ч, затем среду заменяли либо на среду с сывороткой и 3Н-тимидином, либо без 3Н-тимидина. Клетки фиксировали через каждые 2 ч в течение 33 ч. В экспериментах с 3Н-ти-мидином в каждой пробе оценивали уровень радиоактивности и уровень флуоресценции при окрашивании клеток бромистым этидием. Для каждой радиометрической пробы анализировали
не менее 104 клеток, для цитометрического анализа не менее 100 тыс. клеток.
Для оценки морфологических и цитогенетиче-ских нарушений клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах, фиксировали на стеклах этанолом и затем окрашивали ацетоорсеином для последующего анализа на световом микроскопе. Клеточную радиочувствительность оценивали по уровню асимметричных хромосомных аберраций - мостов и фрагментов в анафазе, для каждой экспериментальной точки было просчитано не менее 900 анафаз.
Облучение клеток, растущих либо во флаконах Карреля, либо на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах, проводили на установке "МИДИ" у-квантами при мощности дозы
1 Гр/мин в дозах от 1 до 6 Гр. При статистической обработке данных за повторность принимали число экспериментов (не менее трех), из результатов которых рассчитывали среднее значение и соответствующую ошибку среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены результаты цитометрического анализа состава клеточной популяции асинхронных и синхронизированных сывороточным голоданием клеток после 16, 21, 24, 46 и 48-часового их инкубирования в бессывороточной среде. Из гистограмм, представляющих распределение клеток по содержанию ДНК, видно, что длительное пребывание клеток в питательной среде без сыворотки приводило к аккумуляции их в Сгфазе клеточного цикла (2с = 60-80%) без индукции апоптотической гибели (отсутствие клеток с содержанием ДНК меньше чем 2с). Таким образом, сывороточное голодание индуцирует достаточно хорошую синхронизацию исследуемой клеточной популяции в Сгфазе клеточного цикла. Отсутствие апоптотически погибших клеток после длительного сывороточного голодания по-видимому, является особенностью этих клеток. Для этого же типа клеток (НЦУБС) показано, что сывороточное голодание индуцирует освобождение растворимого медиатора или медиаторов, которые и определяют их резистентность к апоптозам [11].
Используя метод проточной цитометрии, мы оценили параметры клеточного цикла этой линии. Клетки, синхронизированные в Сгфазе 24-часовым культивированием на бессывороточной среде, стимулировали к пролиферации сменой бессывороточной среды на полную и затем оценивали распределение клеток по содержанию ДНК в течение последующих 33 ч. Результаты цитометрического анализа представлены на рис. 2 в виде гистограмм распределения клеток по содержанию ДНК. Из гистограмм видно, что сыво-
700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
250 г
и о
X н о
а о н о ч а о и н о
(О р
и ч
о &
200 150 100 50 0
250 200 150 100 50
0 ч
16 ч
21 ч
200
1_I_И
400
300
200
100
100
0
400
300
200
100
24 ч
1_\..л л_и
0 50 100 150 200 250 0
50 100 150 200 250 Номер канала флюоресценции
Рис. 1. Распределение клеток по содержанию ДНК в зависимости от продолжительности инкубации их в среде без сыворотки.
роточное голодание приводит к аккумуляции клеток в G1 (73%) и части клеток в G2 (22%). G2-клетки в течение первых 10 ч после смены бессывороточной среды на среду с сывороткой переходит в фазу G1, что свидетельствует об обратимости этого блока. Клетки, задержанные в G1, только после 13 ч инкубации в полной среде вступают в £-фазу, достигая максимума (20%) к 2426 ч после смены среды. К 26-31 ч наступает пик G2 (30%). После 31-го ч наблюдается увеличение
числа клеток в G1-фазе. Однако на протяжении исследуемого отрезка времени (33 ч) наблюдается и рассинхронизирование клеточной популяции. Оценить все ли клетки, остановленные сывороточным голоданием в G1, проходят полный клеточный цикл, не предоставляется возможным, поскольку, как видно из гистограмм, доля клеток в G1 не опускается ниже 49% (26 ч после добавления сыворотки). Вполне возможно, что часть клеток находи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.