РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 151-157
^ РАДИАЦИОННАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
ЦИТОЛОГИЯ
УДК 576.35:539.1.04:612.014.482.3
БЛОКИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ Р-ИЗЛУЧЕНИЕМ ОТ ИНКОРПОРИРОВАННЫХ И ВНЕШНИХ ИСТОЧНИКОВ. ^-БЛОК, ИНДУЦИРОВАННЫЙ Р-ЧАСТИЦАМИ 3Н20
© 2007 г. Н. Я. Гильяно*, Л. В. Коневега, С. И. Степанов, Е. Г. Семенова, Л. А. Носким
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Ранее нами было показано, что (0.12-0.46 Гр) Р-частицы, испускаемые при распаде 3Н-тимидина, инкорпорированного в ДНК эндотелиоцитов человека (линия ECV-304), индуцируют аккумуляцию клеток в 62-фазе клеточного цикла. Облучение клеток у-квантами 137Cs в дозах на порядок выше (1-6 Гр) было менее эффективным как в индукции G2-блока, так и выходе хромосомных аберраций. В данной работе сравнивали эффективность Р-частиц, испускаемых при распаде трития в составе 3Н2О и в составе 3Н-тимидина по ряду клеточных параметров. Показано, что при равных условиях инкубирование клеток в среде с 3Н2О приводило к аккумуляции клеток в Б-фазе без снижения ми-тотической активности и повышения уровня хромосомных повреждений, а с 3Н-тимидином к блокированию клеток в О^М фазе, к зависимому от дозы излучения ингибированию митотической активности и повышению уровня хромосомных повреждений. Обработка клеток кофеином снимала аккумуляцию клеток как в 02/М, так и в Б-фазе, что свидетельствует об АТМ-зависимом пути блокирования пролиферации эндотелиоцитов Р-частицами, испускаемыми при распаде трития. Обсуждаются факторы, влияющие на эффективность источников внешнего и "внутреннего" облучения в зависимости от их положения относительно главной чувствительной мишени - ДНК.Ключевые слова: ECV-304, 3Н20, 3Н- тимидин, S-фаза, 02/М-блок, кофеин, радиометрия, проточная цитомет-рия, хромосомные аберрации.
Клетки Е^-304, 3Н20, 3Н-тимидин, клеточный цикл, Б-фаза, 02/М-блок, кофеин, радиометрия, проточная цитометрия, хромосомные аберрации
Биологические эффекты от инкорпорированных источников Р-излучения на клетках млекопитающих исследовались и исследуются достаточно интенсивно. Это обусловлено широким использованием радиометрического метода в медико-биологических исследованиях при изучении синтеза ДНК, РНК и белков. Показано, что Р-частицы, испускаемые тритием, проявляют большую биологическую эффективность по сравнению с у- и рентгеновскими лучами. Излучение трития в окисленной форме при низких дозах и при низкой мощности дозы в 2-3 раза более эффективно, чем у-излучение 137Св или 60Со, а когда тритий связан с органическими молекулами, его ОБЭ возрастает примерно вдвое [1].
Р-Частицы, испускаемые при распаде трития, так же как у-лучи 60Со, классифицируются как излучения с низкими линейными потерями энергии (ЛПЭ). Однако качественно Р-частицы значительно отличаются от у-лучей 60Со, имея некото-
*Адресат для корреспонденции: 188300 Гатчина, Ленинградская обл., ПИЯФ РАН; тел.: (81371) 4-65-94; e-mail: gil-iano@omrb.pnpi.spb.ru.
рые специфические особенности, такие как более высокая средняя ЛПЭ, низкая общая интегральная плотность потока электронов на единицу поглощенной дозы, иное микродозиметрическое распределение для нанометрических мишеней [2].
Нами было показано, что в низких дозах (0.120.46 Гр) Р-частицы, испускаемые при распаде 3Н-тимидина, инкорпорированного в ДНК эндотелиоцитов человека (линия ECV-304), индуцируют накопление клеток в G2-фазе клеточного цикла. Облучение клеток у-квантами 137С$ в дозах на порядок выше (1-6 Гр) менее эффективно в индукции в2-блока. Кроме того, на клетках, облученных Р-частицами, фиксировался довольно высокий уровень нестабильных хромосомных аберраций. Мы предположили, что высокая генотоксичность Р-частиц обусловлена в первую очередь тем, что 3Н-тимидин включается в ДНК клеток и Р-части-цы, испускаемые при распаде инкорпорированного трития, возникают непосредственно в чувствительной мишени (вероятность попадания в ДНК равна 1) в отличие от внешнего облучения у-кван-тами 137Св [3]. При этом следует подчеркнуть, что
эти варианты облучения различались так же по мощности дозы и по энергии излучения.
Целью данной работы было выявление зависимости эффективности ^-источников 3Н от их положения относительно чувствительной мишени при равной мощности дозы и энергии излучения, оцененной по ряду клеточных параметров, на эндотелиоцитах человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Линия трансформированных эндотелиальных клеток человека ECV-304 получена из коллекции клеточного центра Института цитологии РАН. Эндотелиальные клетки культивировали во флаконах Карреля на среде Игла с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки, фирма "Биолот". В качестве антибиотика использовали гентамицин.
В качестве источников мягкого ^-излучения использовали (метил 3Н)-тимидин и 3H2O (фирма "Изотоп" ФГУП, С.-Петербург). Конечная максимальная концентрация изотопа в питательной среде составляла 0.066 МБк/мл как для тимидина, так и для тритиевой воды.
Радиометрический анализ клеточной суспензии проводили на счетчике "Beckman LS 5801" (США). Пробы ДНК из лизированных клеток (не менее 104) переводили на нитроцеллюлозные фильтры. После высушивания фильтры помещали в толуольный сцинтилляционный раствор при радиометрии 3Н-тимидина и в диоксановый раствор при радиометрии 3Н20 и просчитывали в счетчике. Для проточно-цитометрического анализа клеточной пролиферации использовали бромистый этидий фирмы "Sigma" (США).
Цитофлуорометрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили на проточном цитометре, созданном в группе радиобиологии и медицины [4]. Клеткам, культивируемым во флаконах Карреля на питательной среде, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, через сутки среду заменяли на безсывороточ-ную. В питательной среде без сыворотки клетки инкубировали в течение 24 ч, затем среду заменяли либо на среду с сывороткой + 3Н-тимидин, либо без 3Н-тимидина, либо с 3Н20. Фиксировали клетки через 28 ч. В каждой пробе параллельно оценивали уровень радиоактивности и уровень флуоресценции при окрашивании клеток бромистым этидием. Для каждой радиометрической пробы анализировали не менее 104 клеток, для цитометрического анализа от 104 до 105 клеток. Для оценки морфологических и цитогенетиче-ских нарушений клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах, фиксировали на стеклах этанолом и затем окрашивали ацетоорсеином для последующего анализа на световом микроскопе. Клеточную радиочувстви-
тельность оценивали по уровню асимметричных хромосомных аберраций - мосты и фрагменты в анафазе, для каждой экспериментальной точки было просчитано не менее 900 анафаз. Митоти-ческую активность оценивали по уровню митоти-ческих фигур (профазы, метафазы, анафазы и те-лофазы) на 1000 клеток. При статистической обработке данных за повторность принималось число экспериментов (не менее трех), из результатов которых рассчитывали среднее значение и соответствующую ошибку среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы провели серию экспериментов, используя в качестве источника ^-излучения 3Н-тимидин и 3Н20. Таким образом, мы имели возможность сравнить один и тот же источник в-частиц - 3Н. При использовании 3Н-тимидина 3Н в его составе встраивается в чувствительную мишень (ДНК), а при использовании 3Н20 он равномерно распределен по всему объему, и хотя вне чувствительной мишени, но в непосредственной близости от нее. Активности, сроки и продолжительность обработки клеток 3Н20 и 3Н-тимидином были практически идентичными. Таким образом, мы имели возможность исключить различия, определяемые энергией, мощностью дозы и величиной дозы. Клетки, синхронизированные в Сгпериоде инкубированием в среде без сыворотки, стимулировали к пролиферации прибавлением к культу-ральной среде сыворотки и 3Н20 или 3Н-тимиди-на с удельной активностью 0.008; 0.016; 0.033 и 0.066 МБк/мл. Через 28 ч клетки снимали раствором Версена. Одну часть клеточной суспензии анализировали на проточном цитометре, а другую на сцинтилляционном счетчике для определения включения трития в ДНК. Результаты радиометрического анализа не зарегистрировали включения трития в ДНК клеток, инкубированных в среде с 3Н20, в отличие от клеток, инкубированных в среде с 3Н-тимидином (данные не приводятся). Результаты цитометрического анализа (рис. 1) также продемонстрировали существенное различие в последствиях инкубации клеток в среде с 3Н-тимидином и 3Н20. Инкубация клеток с 3Н-тимидином индуцировала аккумуляцию клеток в G2/M (4с) (рис. 1, А). При этом добавление в инкубационную среду немеченого тимидина снимало эффект меченого тимидина, что свидетельствует об определяющей роли инкорпорированной компоненты 3Н. Инкубация с 3Н20 приводила к аккумуляции клеток в «-фазе (3 с) клеточного цикла. Накопление клеток в «-фазе носило зависимый от удельной активности радионуклида характер (0.008 МБк/мл - 26%; 0.033 МБк/мл - 30%; 0.066 МБк/мл - 48%) (рис. 1, Б). С увеличением доли клеток в «-фазе снижалась доля клеток как в G1-фазе, так и в G2-фазе. При этом снижение доли
Количество клеток а Количество клеток б
а2-61%
Номера каналов флуоресценции
Рис. 1. Распределение клеток по содержанию ДНК в зависимости от активности 3Н-тимидина (А), от активности 3Н20 (Б).
клеток в G1-фазе было более существенным, чем в G2. При удельной активности 3Н20 0.066 МБк/мл наблюдалось двукратное снижение доли клеток с содержанием ДНК 2с и полуторократное - для 4с. Снижение доли клеток в G1-фазе свидетельствует о том, что присутствие в среде инкубации клеток 3Н20 не нарушало перехода клеток из G1- в «-фазу. В то время как снижение доли клеток в G2-фа-зе позволяет предположить, что инкубация с
3Н20 нарушала переход клеток из «-фазы в G2-фазу. 0днако снижение количества клеток в G2-фазе может также свидетельствовать и о замедлении прохождения клетками «-фазы клеточного цикла.
Мы проверили данное предположение с помощью радиометрического метода. Клетки, синхронизированные 24-часовым сывороточным голоданием в G1-фазе клеточного цикла, инкубирова-
Относительная
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.