ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 414-420
УДК 547.953+577.336
БРОМАЦИЛЬНЫЕ АНАЛОГИ ФОСФАТИДИЛХОЛИНА С ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНО ПОТУШЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЕЙ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ НЕПРЕРЫВНОЙ РЕГИСТРАЦИИ
АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ А2
© 2004 г. С. В. Бабицкая, М. А. Кисель, П. А. Киселёв
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141, Минск; e-mail: babitskaya@iboch.bas-net.by Поступила в редакцию 05.05.2003 г.
Посредством замены ацильных цепей на остатки пиренмасляной и бромсодержащих жирных кислот получены два новых производных фосфатидилхолина с внутримолекулярно потушенной флуоресценцией. Показана возможность использования обоих соединений для количественной оценки каталитической активности панкреатической фосфолипазы А2 в кинетическом режиме.
Одна из важных сфер применения флуоресцентных липидных зондов - анализ активности липолитических ферментов, в частности фосфолипазы А2 (ФЛА2, КФ 3.1.1.4). ФЛА2 является ли-политическим ферментом, специфически расщепляющим сложноэфирную связь в ,от-2-положении фосфоглицеридов. ФЛА2 животных вовлекается в важные биологические процессы, выполняя роль медиаторов воспаления, пролиферации и апоптоза [1]. Особое внимание исследователей привлекают клеточные ФЛА2. С их участием высвобождается арахидоновая кислота - предшественник биосинтеза эйкозаноидов: лейкотриенов, тромбоксанов, простациклина и простагландинов [2, 3]. Кроме того, образующийся при гидролизе 1-О-алкил-2-ацил-,от-глицеро-3-фосфохолина ли-зофосфолипид служит предшественником фактора активации тромбоцитов. Важная роль ФЛА2 заключается и в поддержании структурной целостности клеточных мембран [4]. Определение активности фосфолипаз, в особенности при их низком содержании, остается сложной и трудоемкой задачей, что обусловливает интерес к разработке новых методов. В настоящее время для этой цели используют широкий круг подходов [5]. Способ проведения анализа во многом определяет его трудоемкость и временные затраты. По этому признаку все методы можно разделить на две группы: не требующие и требующие разделения продуктов гидролиза. Характерным недостатком
Сокращения: БФХ - 1-ю-бромундеканоил-2-[4-(пи-рен-1-ил)бутироил]^п-глицеро-3-фосфохолин; ДБФХ -1-(9,10-дибромстеароил)-2-[4-(пирен-1-ил)бутироил]^п-гли-церо-3-фосфохолин; ДМАП - диметиламинопиридин; ДНФ, ТНФ - ди-, тринитрофенильная группа; ДЦК -дициклогексилкарбодиимид; ФЛА2 - фосфолипаза А2; БОДИПИ - 4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-$-индаценил.
методов первой группы, позволяющим проводить анализ с наименьшими трудозатратами в кинетическом режиме, является относительно невысокая чувствительность. Так, наиболее распространенный из них ацидометрический метод имеет нижний предел определения жирных кислот ~50-100 нмоль/мин [6, 7]. К широко известным методам второй группы относится радиометрический [8, 9]. Он обладает высокой чувствительностью (в пределах нескольких пкмоль/мин), но требует специальных условий для работы с радиоактивным материалом, трудоемок и часто не позволяет достичь высокой эффективности разделения продуктов реакции [10, 11]. Хорошей альтернативой радиометрическому методу стали подходы с использованием окрашенных субстратов и субстратов, несущих флуоресцентную метку в гидрофобной или гидрофильной области липидной молекулы [12-23]. Часто они по своей чувствительности сравнимы с радиометрическим анализом, но более просты в исполнении и характеризуются меньшими временными затратами. К сожалению, при гидролизе многих субстратов с хромофорными группами не наблюдается ярко выраженных спектральных изменений, что ограничивает их применение в режиме непрерывного контроля за ходом ферментативного процесса. Поэтому в последние годы возрос интерес к конструированию фосфолипидных зондов с внутримолекулярно потушенной флуоресценцией, которая резко возгорается при ферментативном гидролизе субстрата и последующем выходе продуктов реакции из мицелл в водную среду [24, 25]. Для достижения эффективного тушения в молекулу фосфолипида вводится флуорофор и тушитель его флуоресценции. При этом, как правило, модификации подвергается как ацильная цепь, так и полярная
О
Бг О
Рис. 1. Структурные формулы синтезированных липидных аналогов: 1 - БФХ, 2 - ДБФХ.
часть исходной молекулы липида. Однако модификация последней часто нежелательна, поскольку функциональные свойства фосфолипид-ной молекулы, в первую очередь, обусловливаются строением полярной головки [26]. Поэтому более перспективным направлением в создании такого типа субстратов может стать введение флуорофора и тушителя лишь в ацильные цепи липида. Примером такого подхода является недавний синтез аналога фосфатидилхолина с 4,4-диф-тор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-з-индаценилом (флуорофор) и тушителем - динитрофенильной группой в и т-2 положениях соответственно [25]. Однако удельная активность панкреатической ФЛА2 по отношению к синтезированному субстрату оказалась очень низкой, что авторы объясняют присутствием в гидрофобной области липида двух объемных и к тому же достаточно гидрофильных заместителей.
С учетом этого нами были синтезированы два новых фосфолипидных зонда с внутримолекулярно потушенной флуоресценцией - 1-ю-бромундекано-ил-2-[4-(пирен-1-ил)бутироил]-5«-глицеро-3-фос-фохолин и 1-(9,10-дибромстеароил)-2-[4-(пирен-1-ил)бутироил]-5«-глицеро-3-фосфохолин (рис. 1). В качестве флуорофора в обоих случаях использовали остаток пиренмасляной кислоты, не приводящий к нарушению гидрофильно-гидрофобного баланса в липидной молекуле, а для тушения флуоресценции - атомы брома, связанные с остатками ундекановой и стеариновой кислот. Важное преимущество атомов галогенов заключается в их относительно небольшом влиянии на организацию бислоя, сравнимом с таковым двойной связи [27].
Цель работы - синтез бромацильных аналогов фосфатидилхолина с повышенной субстратной
специфичностью к ферменту для непрерывной регистрации активности панкреатической ФЛА2.
МЕТОДИКА
Синтез липидных субстратов. Аддукт sn-гли-церо-3-фосфохолина с хлористым кадмием аци-лировали ангидридами ю-бромундекановой или 9,10-дибромстеариновой кислоты в присутствии ДМАП [28]. Бромсодержащие 1,2-диацил-,от-гли-церо-3-фосфохолины деацилировали по sn-2 положению с помощью ФЛА2 в смешанных мицеллах с дезоксихолатом натрия [25]. Лизофосфоли-пиды реацилировали пиренмасляной кислотой в присутствии ДМАП и ДЦК [29]. Продукты были очищены флэш-хроматографией на силикагеле. Для обнаружения веществ на хроматограммах использовали флуоресценцию при УФ-облучении и молибдатный реагент на фосфолипиды [30]. ТСХ: Щ 0.36 и 0.40 для БФХ и ДБФХ соответственно. Спектр ХН-ЯМР БФХ (СБС13, 5, м. д.): 1.24-1.30 (м, 14Н, СН2), 1.48 (м, 2Н, РугСН2СНгСН2), 1.79 (м, 2Н, ВгСН9СН9), 2.102.18 (т перекр., 4Н, СН2СОО), 2.40 (т, 2Н, РугСНт), 3.20 (с, 9Н, №(СН3)3), 3.30 (т, 2Н, ВгСН2СН2), 3.35 (т, 2Н, СН2СН2М), 3.87 (м, 4Н, ОСН9СНСН9О), 3.97 (т, 2Н, СН9СН9Ю, 5.30 (м, 1Н, СНО), 7.78-8.12 (м, 9Н, пиренил). Спектр ХН-ЯМР ДБФХ (СБС13, 5, м. д.): 0.87 (т, 3Н, СН3СН9), 1.27-1.33 (м, 22Н, СН2), 1.47 (м, 2Н, РугСН9СН9СН9), 1.75 (м, 4Н, СНВгСН2), 2.10-2.18 (т перекр., 4Н, СН2СОО), 2.40 (т, 2Н, РугСЩ, 3.20 (с, 9Н, №(СН3)3), 3.32 (т, 2Н, СН9СН9N), 3.86 (м, 4Н, ОСН9СНСН9О), 3.95 (т, 2Н, СН9СН9N), 4.20 (м, 2Н, СНВгСИВг), 5.30 (м, 1Н, СНО), 7.788.12 (м, 9Н, пиренил).
I, отн. ед.
350
400
450
500
550
600 X, нм
Рис. 2.Спектры флуоресценции БФХ: 0.1 мкМ раствор в метаноле (1); 10 мкМ раствор в водной среде (2). Длина волны возбуждения 340 нм. Ширина щели возбуждения 5 нм, щели регистрации флуоресценции 2 нм.
ТСХ проводили на пластинках "Merck" (Германия) в системе хлороформ-метанол-28%-ный NH4OH (13 : 5 : 1 по объему). В работе использовали свежеперегнанные растворители. Спектры флуоресценции регистрировали на автоматизированном спектрофлуориметре "Solar 1211 А" (Беларусь), 1Н-ЯМР-спектры - на приборе "Bru-ker АС-200", используя ТМС в качестве внутреннего стандарта.
Получение кинетических кривых гидролиза флуоресцентно меченных липидов ФЛА2. Мицел-лярная форма субстрата была приготовлена быстрым впрыскиванием 20 мкл 1.0 мМ раствора флуоресцентно меченного фосфолипида в абсолютном этаноле в кювету спектрофлуориметра, содержащую 2.0 мл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7.4, 0.1 мМ ЭДТА). Затем в реакционную смесь добавляли 20 мкл раствора ФЛА2 с определенным содержанием белка (конечная концентрация ФЛА2 составляла от 0.1 до 10 нМ). Реакцию начинали добавлением 20 мкл раствора 0.4 М ацетата кальция. Кювету термостатировали при 37°С в циркулирующей водяной бане, смесь непрерывно перемешивалась с помощью магнитной мешалки, вмонтированной в термоблок спектро-флуориметра.
Определение минимально регистрируемого количества ФЛА2 по конечной точке. Эксперименты по определению минимально регистрируемого количества ФЛА2 проводили в соответствии с методикой получения кинетических кривых гидролиза флуоресцентно меченных липидов (см. выше). В реакционную смесь добавляли 20 мкл раствора ФЛА2 до конечной концентрации белка от 0.2 до 10 нМ. Реакцию начинали добавлением 20 мкл раствора 0.4 М ацетата кальция. Реакцию останавливали добавлением 20 мкл раствора 1 М
ЭДТА. После построения кинетических кривых гидролиза для каждого значения концентрации ФЛА2 либо на прямолинейном участке кривой, либо на касательной к ней определяли значение интенсивности мономерной флуоресценции пирено-вого хромофора на момент времени 30 мин и строили график зависимости интенсивности мономерной эмиссии от концентрации ФЛА2. На прямолинейном участке через обозначенные точки проводили прямую линию, экстраполируя ее до точки пересечения координат. По калибровочной кривой, показывающей зависимость интенсивности эмиссии пиренмасляной кислоты при 378 нм от ее концентрации в присутствии соответствующего субстрата, определяли минимальное изменение интенсивности флуоресценции, являющееся достоверным для данного субстрата, после чего устанавливали предельное регистрируемое количество ФЛА2.
Материалы: В работе использовали N,N'-^-циклогексилкарбодиимид, пиренмасляную, ю-бром-ундекановую, 4-диметиламинопиридин фирмы "Fl
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.