МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 236-243
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.8+579.695
CANDIDATUS "JETTENIA MOSCOVIENALIS" SP. NOV. - НОВЫЙ ВИД БАКТЕРИЙ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ АНАЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ
© 2015 г. Ю. А. Николаев*, **, М. Н. Козлов*, М. В. Кевбрина*, А. Г. Дорофеев*, Н. В. Пименов**, А. Ю. Каллистова**, В. А. Грачев*, Е. А. Казакова*, А. В. Жарков*, Б. Б. Кузнецов***, Е. О. Патутина*, Б. К. Бумажкин*
*Инженерно-технологический центр АО Мосводоканал **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва ***Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 27.08.2014 г.
В активном иле полупромышленного биореактора, очищающего фильтрат сброженного осадка сточных вод Курьяновских очистных сооружений (г. Москва), выявлены и охарактеризованы по физиологическим, морфологическим и молекулярно-биологическим показателям представители нового вида бактерий, окисляющих аммоний нитритом в бескислородных условиях. Клетки бактерий овоидной формы, «0.5 х 0.8 мкм, имеют внутриклеточные мембранные структуры, характерные для анаммокс-бактерий: анаммоксосому, парифоплазму, а также, в отличие от других анаммокс-бактерий, обширные внутриклеточные мембранные структуры, располагающиеся слоями параллельно цитоплазматической мембране, и никогда — в области анаммоксосомы. Клетки объединены в агрегаты диаметром 5—28 мкм, легко адгезируют к твердым поверхностям. Клетки морфологически лабильны — легко подвергаются плазмолизу, теряют содержимое. Время удвоения — 28 сут.; цмакс = = 0.025 сут-1; температурный оптимум роста 20—45°C, оптимум рН 8.0. По результатам филогенетического анализа последовательностей нуклеотидов генов, кодирующих 16S рРНК, бактерия отнесена к новому виду рода-кандидата Jettenia, принадлежащего к порядку Planctomycetales. Для новой бактерии предложено название Candidatus "Jettenia moscovienalis" sp. nov.
Ключевые слова: анаэробное окисление аммония, новый вид, описание, Candidatus "Jettenia moscovienalis" sp. nov., очистка сточных вод.
DOI: 10.7868/S002636561502010X
Открытые относительно недавно бактерии, окисляющие аммоний нитритом в бескислородных условиях [1], интенсивно изучаются исследователями всех стран, поскольку этим бактериям отводят важную роль в круговороте азота в водных экосистемах [2, 3]. Процесс анаэробного окисления аммония (анаммокс-процесс) используется в высокоэффективных и экономичных технологиях очистки сточных вод от азота [2, 4], и масштаб применения этих технологий постоянно и быстро растет [5, 6]. В настоящее время известно 6 родов анаммокс-бактерий. Более половины видов выделены из активных илов очистных сооружений [2]. Несмотря на все усилия, не описано ни одного валидного вида анаммокс-бакте-рий, т.к. пока никому не удалось выделить эти бактерии в чистую культуру. Несмотря на то, что в международную базу Генбанк внесено более
1 Автор для корреспонденции (e-mail: nikolaevya@mail.ru).
12000 нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК анаммокс-бактерий [9], выделено в накопительную культуру, исследовано и описано только 10 видов этих организмов. Все они описаны как виды-кандидаты в соответствии с рекомендациями международной комиссии по номенклатуре бактерий [7, 8]. Поэтому задача описания новых видов анаммокс-бактерий остается актуальной.
Ранее был описан новый род и вид анаммокс-бактерий, Сandidatus "АпатшохошюгоЪшш то8-cowii", обитающих в реакторе очистки фильтрата сброженного осадка Курьяновских очистных сооружений, работающего при температуре 15—25°С [10]. В результате работ по интенсификации процесса очистки фильтрата сброженного осадка была создана технология анаэробного окисления аммония при более высокой температуре, до 38°С [11, 12]. Ключевым биокатализатором этой техноло-
гии является новая анаммокс-бактерия, описанию которой и посвящена настоящая работа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Накопительная культура анаммокс-бактерий
представляла собой активный ил (АИ) биореактора очистки фильтрата сброженного осадка сточных вод Курьяновских очистных сооружений (КОС) Москвы, работающего в режиме реактора периодического действия при температуре 29—31°C [11, 12]. В реактор объемом 350 л подавали фильтрат сброженного осадка сточных вод КОС (после метанового сбраживания при температуре 55°C). Фильтрат содержал: N—NH4 — 220—330 мг/л, химическое поглощение кислорода (ХПК) — 1400— 4500 мг/л, взвешенные вещества (ВВ) —1500— 4000 мг/л, биологическое поглощение кислорода в течение пяти суток (БПК5) — 110—330 мг/л, Р— РО4 — 10—12 мг/л). Реактор был инокулирован двумя типами материалов, содержащих бактерии: 1) сброженным осадком КОС, как возможным источником анаммокс-бактерий, и 2) активным илом аэротенков КОС, содержащим нитрифицирующие бактерии [13]. Заметное удаление азота (более 15% от его содержания в поступающей воде) началось после 170 дней работы реактора. В это время активный ил начал приобретать бурый оттенок, на элементах конструкции отмечено появление розового налета. При дальнейшем культивировании и достижении 70% удаления азота (400-ый день опыта) во флотационной пене начали образовываться оранжевые гранулы, а на внутренних элементах конструкции реактора (стенки, трубки, аэратор, мешалка) ил обрастания приобрел красно-оранжевый цвет. Для проведения филогенетических, микроскопических и физиологических исследований этот "красный ил обрастания" соскабливали резиновым скребком, собирали в колбу, измельчали путем интенсивного встряхивания.
Исследование физиологии анаммокс-бактерий. Для определения физиологических показателей бактерий, осуществляющих анаэробное окисление аммония (скорости роста, оптимумов температуры и рН), применяли стандартные методы. Активность бактерий считали пропорциональной скоростям потребления аммония и нитрита (в лабораторных опытах) или скорости удаления азота (при развитии бактерий в описанном выше реакторе). Скорости потребления аммония и нитрита расчитывали по скорости снижения концентраций этих соединений. Опыты проводили в стеклянных флаконах ("Falcon") объемом 100 мл в стандартных условиях (концентрация биомассы составляла 0.9—1.1 г беззольного вещества (БВ)/л, температура и рН варьировали). Для предупреждения попадания кислорода в реакционную смесь во время исследований стеклянные емко-
сти наполняли полностью, продували азотом и под током азота плотно закрывали крышкой с резиновой прокладкой. Для каждой экспериментальной точки использовали все содержимое флакона. Удельную активность биомассы активного ила выражали в мг азота аммония и нитрита, метаболизированных 1 г беззольного вещества (БВ) активного ила за 1 ч (мг N/г БВ АИ ч).
Концентрации компонентов среды определяли стандартными методами: NH+ — фотометрически с реактивом Несслера; NO— — фотометрически с реактивом Грисса (спектрофотометр DR2010, "Hach", США); взвешенных веществ — гравиметрически (весы AC211S, "Sartorius", Германия); химическое поглощение кислорода (ХПК) — бихроматным методом; биологическое поглощение кислорода (БПК5) — манометрически (в склянках Oxitop, "WTW", Германия) в соответствии с руководством [14].
Морфологию клеток исследовали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии (эпифлуоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan 2, Германия), а также электронной микроскопии (просвечивающий электронный микроскоп JEM-100C, "Jeol", Япония) при напряжении 80 кВ и увеличении х20000). Для электронной микроскопии суспензию активного ила и препараты готовили, как описано ранее [15]. Для визуализации и идентификации анаммокс-бакте-рий использовали метод FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) с флуоресцентно-мечеными (Су3) олигонуклеотидными зондами Pla46 (специфичным для последовательностей генов 16S рРНК известных представителей порядка Planctomyce-tales) и Amx368 (специфичным для последовательностей генов 16S рРНК известных анаммокс-бактерий семейства Brocadiaceae) [16, 17].
Молекулярно-биологические и филогенетические исследования. Выделение препаратов тотальной ДНК бактериального сообщества активного ила проводили, как это описано ранее [18]. Амплификацию фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК проводили с использованием специфичной для представителей порядка Planctomycetales праймерной системы Pla46F-Univ1392R [16]. Клонирование полученных ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК проводили с использованием набора реактивов pGEM-T Easy system ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя, секвенирование - по методу Сэнгера [19] с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 ("Applied Biosystems, Inc.", США) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 ("Applied Biosystems, Inc.", США). Выравнивание нуклеотид-ных последовательностей клональных вставок с последовательностями, полученными из международных баз данных, построение филогенетиче-
о
£ 1ч
300 250 200 150 100 50
0
20 40 60 80 100 120 140 160 Сутки
Рис. 1. Динамика удаления азота из реактора (г К/сут) в ходе наращивания биомассы активного ила, обладающего анаммокс-активностью.
ских схем (дендрограмм) проводили при помощи программного пакета MEGA 5.2 [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Физиология новых бактерий. После инокули-рования реактора активным илом и сброженным осадком КОС заметное удаление азота (расчитан-ное как разница между содержанием всех форм азота в поступающей и очищенной воде) началось после 170 сут работы реактора, когда было отмечено удаление более 15% азота. Удаление 70% азота наблюдалось после 15 мес. работы реактора. По мере работы реактора скорость удаления азота возросла в 40 раз, что свидетельствовало о накоплении анаммокс-бактерий. Наивысшая достигнутая удельная скорость удаления азота в реакторе составила 0.82 г К/г БВ • сут. После 15 мес. работы реактора на стенках и элементах
конструкции реактора был сформирован красно-оранжевый налет, который обладал высокой анаммокс-активностью и послужил объектом данного исследования.
Для определения скорости роста бактерий в реакторе было оставлено небольшое количество красного ила обрастания в качестве инокулята, при этом скорость удаления азота из реактора сос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.