ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 4, с. 447-451
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.461
ЧИСЛЕННОСТЬ И РАЗМЕРЫ БАКТЕРИЙ В ХОДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ИХ МЕЛКИХ ФОРМ
© 2015 г. Л. М. Полянская, Р. Б. Городничев, Е. А. Воробьева, Д. Г. Звягинцев
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1
e-mail: lpolyanskaya@mail.ru Поступила в редакцию 14.04.2014 г.
Методом "каскадной" фильтрации проанализированы численность, размеры и биомасса почвенных бактерий горной лугово-степной почвы Таджикистана и светлого серозема пустыни Негев. Показано, что при культивировании мелких фракций почвенных бактерий общая численность увеличивается в 1.5 раза, а размеры бактерий становятся более крупными. В обеих почвах значительно увеличилась численность крупных клеток с размерами 1.85 и 0.43 мкм. Если в исходных почвах вклад этих фракций был около 10—20%, то в инкубированных фильтратах он возрос до 50—60%. В исходных почвах клетки с размерами 0.38 и 0.23 мкм составляли около 70% всей численности бактерий, в инкубированных фильтратах — около 30% в фильтрате клеток 0.23 мкм и 45—50% в фильтрате клеток 0.38 мкм. Средний диаметр бактерий возрос с 0.4 до 0.8—0.9 мкм. Вследствие увеличения численности крупных клеток после культивирования биомасса бактерий в этих фильтратах возросла в 7—8 раз по сравнению с исходными почвами.
Ключевые слова: Mollic Leptosols, Haplic Calcisols (Endosalic, Yermic), бактерии, размер клеток, культивация, биомасса.
DOI: 10.7868/S0032180X15040073
Предполагают, что малый размер бактерий в почве определяют естественные условия, которые лимитируют их развитие питательными веществами или стрессовыми ситуациями. Во многих образцах из озер, рек, почвы, снега и дождевой воды с помощью эпифлуоресцентного микроскопа обнаружены мелкие бактериальные клетки с минимальным размером 0.2 мкм, который считается наименьшим [14], как ответная реакция клеток на неблагоприятные условия среды и стресс-факторы, которые изучались в лабораторных экспериментах [10]. Установлено, что культивирование полученных наноформ на богатых питательных средах приводит к возврату исходных форм [1, 6, 11, 20].
Проведенные ранее исследования с подращиванием клеток в фильтратах почвенной суспензии (с диаметром 0.23 мкм), в термостате при температуре 28° показало, что клетки бактерий интенсивно размножались при инкубировании, что было зафиксировано классическим методом по увеличению численности на стеклах [9]. Следует отметить, что подращивание клеток проводили в почвенной суспензии без внесения дополнительных питательных субстратов.
Цель работы — изучить численность и размер клеток бактерий до и после культивирования их
мелких форм (0.23 и 0.38 мкм) при благоприятных условиях (влажности и температуры).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на двух образцах ксерофитных почв. Образец горной лугово-степ-ной субальпийской обычной рыхлодернинной маломощной почвы (МоШе Ьер1о8ок)Таджики-стана отобрали в 20 км на северо-запад от Душанбе, на высоте 1000 м над ур. м. с глубины 0—5 см в ноябре 2010 г. Образцы помещали в стерильные пакеты, 8 ч хранили при температуре —4°С, затем в течение 8 ч доставляли в лабораторию и далее хранили при —18°С.
Образец серозема светлого лёссового остаточ-но-солончакового субтропического жаркого не-промерзающего (ИарИе Сакьзок (Епёо8аИе, Уег-ше)) брали из пустыни Негев (Израиль). Место отбора расположено на высоте 600—800 м над ур. м., в районе тропического, очень засушливого климата. Среднегодовая температура +12°С в январе и +27°С в июле. Среднегодовое количество осадков от 50 до 300 мм, с июня по октябрь в этом районе они не выпадают. Почвы формируются в условиях непромывного режима, что приводит к накоплению в профиле и подпочвенных слоях карбонатов, сульфатов и хлоридов.
млн кл./г почвы 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
А
1.85 0.43
0.38 0.23 Б
0.17
X
0
1.85 0.43 0.38 0.23 0.17 Размер клеток, мкм Ы Ш2 0 3
X
Рис. 1. Распределение по размерам и суммарная численность клеток бактерий (Е) в исходных (1) горной лугово-степной почве (А) и сероземе светлом (Б) и подращиваемых в термостате при температуре 28° С мелких форм бактерий 0.23 (2) и 0.38 мкм (3).
В качестве основного приема предварительной обработки образцов для микробиологического анализа использовали ультразвуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (22 кГц, 0.44 А, 2 мин) [4].
При определении численности бактерий и фракционировании их по размерам использовали метод "каскадной" фильтрации: фильтровали почвенную суспензию 1 мл из разведения 1 : 100, через ядерные фильтры (производство Дубна) с диаметром пор 1.85, 0.43, 0.38 и 0.23 мкм и мембранные фильтры "Сынпор" с диаметром пор 0.17 мкм. Фильтрацию проводили с помощью вакуумного насоса и колбы Бунзена. Собственную люминесценцию фильтров гасили окрашиванием насыщенным спиртовым раствором Судана черного (Germany). Ядерные фильтры помещали в этот раствор на несколько суток, мембранные фильтры — на несколько часов, затем промывали в стерильной воде, подсушивали и использовали для фильтрования [13].
На поверхность сеточки металлического фильтра колбы Бунзена помещали четыре слоя фильтровальной бумаги, сверху фильтр (ядерный
или мембранный), который прижимали к поверхности прибора с помощью металлического кольца, и добавляли фильтруемую суспензию. Фильтрование суспензии проводили последовательно от фильтра с большим размером пор к меньшему. На каждом фильтре (использовали три повторных фильтра) подсчитывали число бактерий и вычисляли их численность, условно принимая размер клеток, равным или чуть большим диаметру пор фильтра, на котором они осаждались. В расчетах принимали, что клетки имеют шаровидную форму, что подтверждено данными электронной и сканирующей микроскопии [8].
Суспензии бактерий обеих почв были профильтрованы через фильтры с порами 0.23 и 0.38 мкм, а полученные фильтраты культивировали в термостате при температуре 28°С в течение 136 ч, после чего была проведена "каскадная" фильтрация этих суспензий, и полученные результаты сравнивали с данными "каскадной" фильтрации в исходных почвах.
Расчет количества клеток в 1 г почвы проводили по формуле:
N = 51an/v52с,
где N — число клеток на 1 г почвы; 51 — площадь препарата, мкм2; а — количество клеток в одном поле зрения (усреднение производили по всем фильтрам); я — показатель разведения почвенной суспензии, мл; V — объем профильтрованной суспензии, мл; 52 — площадь поля зрения микроскопа, мкм2; с — навеска почвы, г.
При расчетах бактерий по обычной методике сухой вес бактериальной клетки объема 0.1 мкм3 принимали равным 2 х 10-14 г [5]. Масса клетки реального размера была пропорциональна массе клетки объема 0.1 мкм3.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ $1а1§гарЫс8 и $1а1А511са. Среднее квадратическое отклонение (8„ -1) для значений численности бактерий в образце не превышало 5—10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходная суммарная численность клеток бактерий, полученная на фильтрах посредством "каскадной" фильтрации исходных почв, в горной лугово-степной почве и в сероземе светлом составила около 1 млрд кл./г почвы.
В горной лугово-степной почве имеются существенные отличия между численностями клеток бактерий разных фракций в исходной почве и инкубированных фильтратах (рис. 1А). В обеих фракциях (0.23 и 0.38 мкм) горной лугово-степ-ной почвы после культивирования примерно в 6 раз увеличивается численность клеток размером 1.85 мкм. Численность клеток размером
II
0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
У////////Л
Исходная почва 0.23
Размер клеток, мкм
0.38
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
Исходная почва 0.23
Размер клеток, мкм
0.38
Рис. 2. Объем (А) и диаметр (Б) средней клетки бактерий в исходных горной лугово-степной почве (I) и сероземе светлом (II) и после подращивания в термостате при температуре 28°С фильтратов 0.23 и 0.38 мкм.
0.43 мкм во фракции 0.23 мкм увеличилась в 8 раз, а во фракции 0.38 мкм — в 4 раза. Численность клеток размером 0.38, 0.23 и 0.17 мкм не изменялась или была немного ниже, чем в исходной почве.
Как следует из рис. 1Б, в сероземе светлом различия между численностью клеток бактерий разных фракций в исходной почве и в инкубированных фильтратах существенны. В обеих фракциях светлого серозема (0.23 и 0.38 мкм) после культивирования в 8 раз увеличилась численность крупных клеток с размерами 1.85 мкм. Численность клеток бактерий с размерами 0.43 мкм в обоих культивированных фильтратах незначительно увеличилась, а численность бактерий размером 0.38 и 0.17 мкм в процессе культивирования фильтрата фракции 0.38 мкм практически не изменилась. Численность клеток размером 0.23 мкм в обоих фильтратах и размером 0.38 мкм во фракции 0.23 мкм уменьшилась вдвое по сравнению с исходной почвой.
Видно, что в обеих почвах значительно увеличилась численность крупных клеток 1.85 и 0.43 мкм. Если в исходных почвах вклад этих фракций был около 10—20%, то в инкубированных фильтратах он возрос до 50—60%. В исходных почвах клетки размером 0.38 и 0.23 мкм составляли около 70% всей численности бактерий, а в инкубированных фильтратах — около 30% в фильтрате клеток 0.23 мкм и 45—50% в фильтрате
клеток 0.38 мкм. Также в обеих почвах в культивированном фильтрате 0.23 мкм прослеживается тенденция к более равномерному распределению численностей крупных клеток (1.85, 0.43 и 0.38 мкм), тогда как в фильтрате 0.38 мкм наибольший вклад вносят клетки размером 1.85 и 0.38 мкм, а численность клеток размером 0.43 мкм относительно мала. Вследствие этого перераспределения происходит увеличение среднего объема и диаметра бактерий (рис. 2).
Биомасса в исходной горной лугово-степной почве составляла около 40 мкг/г почвы, в инкубированных фильтратах 0.23 и 0.38 мкм значения увеличились до 250 мкг/г.
Биомасса в исходном светлом сероземе равнялась примерно 35 мкг/г почвы, в инкубированном фильтрате 0.23 и 0.38 мкм она увеличилась до таких же размеров, как и в горной лугово-степной почве (250—280 мкг/г).
Как видно из таблицы, основной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.