РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2009, том 49, № 1, с. 34-41
АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
УДК 612.014.481.1:612.112.94:57.017.3:577.216.9
СрО-ДНК ИНГИБИРУЕТ КЛЕТОЧНЫЕ РЕАКЦИИ, СОПРОВОЖДАЮЩИЕ РАЗВИТИЕ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ
© 2009 г. А. В. Ермаков, М. С. Конькова, С. В. Костшк, Е. А. Калашникова, С. Н. Кокаровцева, Н. А. Еголина, Н. Н. Вейко*
ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
На лимфоциты периферической крови здоровых доноров воздействовали рентгеновским излучением (10 сГр) или введением в инкубационную среду необлученных клеток фрагмента ДНК транскрибируемой области рибосомного гена (ТОрДНК). Оба фактора индуцировали в лимфоцитах транспозицию (перемещение) локусов Ц12 гомологичных хромосом из прицентромерной области к центру ядра; инициировали активацию экспрессии генов ТЬЯ9 и МуБ88, ядрышкообразующих районов хромосом, ФНО-а и каспазы 3; повышали нуклеазную активность и синтез РНК в клетках. Однако при совместном действии радиации и ТОрДНК все исследованные реакции в клетках не развивались, только значительно возрастал уровень активности цитокина ФНО-а. Обсуждаются реакции лимфоцитов человека на оказываемые воздействия.
Лимфоциты человека, рентгеновское излучение в малых дозах, транскрибируемая область рибосомного гена, транспозиция локусов хромосом, ядрышкообразующие районы хромосом (ЯОР), ТЬЯ9/Му088, ФНО-а.
Бытовая и производственная необходимость вынуждает человека часто контактировать с ионизирующей радиацией в малых дозах. Например, в медицинской практике диагностическая доза (малая доза) составляет не более 10 сГр [1], в то же время она может оказаться достаточной для увеличения риска развития злокачественного образования у пациента. При действии излучения в дозах меньших или равных 10 сГр в клетках индуцируется адаптивный ответ (АО) - сложная реакция, при которой воздействие генотоксических агентов в малых (адаптирующих) дозах вызывает резистентность клеток к последующему воздействию этих или других факторов в повреждающих дозах.
Механизмы развития АО до конца не изучены. Известно, что радиация в малых дозах может действовать как митоген [2], оказывая на клетки стимулирующее влияние. Считается существенным участие в развитии этой реакции процессов репарации ДНК, апоптоза, всевозможных каскадов сигнальных реакций, конформационных изменений ДНК и структурной реорганизации хроматина, эффекта свидетеля (ЭС) и контроля клеточного цикла. В ходе развития АО повышается экспрессия некоторых (частично идентифициро-
*Адрес для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1, МГНЦ РАМН; тел.: (499) 612-81-93; факс: (495) 324-07-02; e-mail: ribgene@rambler.ru.
ванных) генов; в феномене АО отмечена роль ми-тоген-активируемых протеинкиназ (МАРК) и ки-назы 1/2 (БЯК1/2), ядерного транскрипционного фактора карра-В (№-кВ) и продукции активных форм кислорода и азота [3].
Развитие индуцированного действием рентгеновского излучения (10 сГр) АО в в0-лимфоцитах человека ранее мы регистрировали по нескольким параметрам. Так, были обнаружены транспозиция (перемещение) прицентромерных локусов (^12) гомологов 1-й хромосомы из примембран-ной области к центру ядра и активация транскрипции рРНК в ядрышках; эти реакции сопровождались усилением экспрессии генов ТЬЯ9 и МуЭ88, а также повышением уровня активности фактора некроза опухолей а (ФНО-а) и каспазы 3 [4-6]. В цитированных работах было показано, что ионизирующее излучение (10 сГр) индуцирует выход в инкубационную среду лимфоцитов фрагментов внеклеточной ДНК (вкДНК), которые стимулируют в необлученных лимфоцитах ЭС, сопровождающийся реакциями транспозиции локусов и активации ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом, т.е. начальными этапами развития АО. Ключевую роль в развитии АО как в облученных, так и необлученных лимфоцитах-свидетелях играет окислительный стресс (ОС) [6].
Известно, что после облучения организма вкДНК погибших радиочувствительных клеток
подвергается ферментативной деградации и частично поступает в систему кровообращения [7]. Ранее мы показали, что в составе вкДНК плазмы крови облученных людей накапливаются Срв-богатые фрагменты геномной ДНК, в частности фрагменты транскрибируемой области рибосом-ного повтора (ТОрДНК), и снижается содержание АТ-богатых последовательностей ДНК [8]. В сыворотке крови человека обнаружены антитела к фрагментам ТОрДНК [9]. При анализе первичной последовательности ТОрДНК человека выявлено присутствие большого количества неметили-рованных Срв-содержащих мотивов связывания с 'ЧоП"-рецепторами (ТЬЯ9) антигенпрезентирую-щих клеток [8]. Увеличенное содержание Срв-динуклеотидов во вкДНК не является специфическим маркером действия радиации. Прежде всего это маркер повышения частоты гибели клеток организма, не зависимо от причин, ее вызвавших. Например, значительное увеличение содержания Срв-динуклеотидов во вкДНК обнаружено у больных аутоиммунными заболеваниями [10].
Являясь потенциальными лигандами для ТЬЯ9, Срв-богатые фрагменты вкДНК могут стимулировать клетки иммунной системы аналогично другим известным лигандам - бактериальной ДНК и синтетическим Срв-олигодезоксири-бонуклеотидам (Срв-ОДН) [11]. Например, известно, что Срв-ОДН повышает активность Т-хелпера 1, стимулирует синтез ИЛ-6 и ИЛ-10 В-лимфоцитами, интерферона у клетками КК (натуральные киллеры), интерлейкинов ИЛ-6, ИЛ-12 и ИЛ-18, ФНО-а и интерферона а моноцитами и дендритными клетками [12]. Ранее в наших исследованиях мы обнаружили, что действие модельных фрагментов ТОрДНК вызывает в в0-лимфоцитах человека эффекты, похожие на действие радиации в малых дозах [13]. Возникает вопрос, к каким клеточным эффектам может приводить совместное действие на клетки иммунной системы двух стимулирующих факторов: радиации в малых дозах и Срв-богатых фрагментов вкДНК (в частности фрагментов ТОрДНК), которые накапливаются при усилении процесса гибели клеток в организме?
Для ответа на этот вопрос в настоящей работе мы воздействовали на лимфоциты человека рентгеновским излучением (10 сГр) и модельными фрагментами ТОрДНК. Клеточный ответ оценивали по ряду параметров: транспозиции ло-кусов хромосом и активации ЯОР, синтезу РНК и экспрессии ТЬЯ9/Му088, оценке активности эндо-нуклеаз, каспазы 3 и ФНО-а. В результате проведенного исследования впервые было показано, что действие радиации в малых дозах на фоне повышенного содержания Срв-богатых фрагментов ДНК в среде культивирования может в большой части клеток приводить к блокированию реакций, сопровождающих развитие АО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов. Нестимулированные О0-лимфоциты выделяли путем центрифугирования в системе фиколл-урографин ("Панэко", Россия) из гепаринизированной периферической крови здоровых мужчин в возрасте от 30 до 50 лет.
Обработка и инкубирование лимфоцитов. Лимфоциты облучали при 20°С на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Амплитуда напряжения на рентгеновской трубке =160 кВ, максимум в спектре излучения = 60 кэВ, мощность дозы составляла 0.16 Гр/мин. В других вариантах в инкубационную среду вводили фрагмент ТОрДНК или добавляли его сразу же после облучения. В качестве источника CpG-богатой ДНК использовали линеаризованную плазмиду, содержащую фрагмент ТОрДНК (участок от 515 до 5321 нуклеотидов в соответствии с HSU 13369, "GeneBank") и встроенную в вектор pBR322. Препарат вводили в конечной концентрации 50 нг/мл; клетки инкубировали в растворе Хенкса, содержащем 1 ммоль/л HEPES ("Fluka") и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США). После облучения, введения ТОрДНК или их совместного воздействия лимфоциты инкубировали в течение 3 ч при 37°С.
Приготовление клеточных препаратов. Лимфоциты осаждали центрифугированием. Клетки инкубировали 20 мин при 37°С в растворе 0.075 моль/л KCl и центрифугировали. Полученные осадки переводили в холодную фиксирующую смесь - метанол/ледяная уксусная кислота (3 : 1) и центрифугировали, повторяя эту операцию дважды. Переведенный в малый объем фиксатора клеточный материал переносили на влажные охлажденные стекла и высушивали. Часть препаратов использовали для анализа методом флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), другую часть через 10 сут окрашивали азотнокислым серебром, используя разработанную ранее методику [14]. Для оценки изменения активности ядрышек определяли их суммарную площадь не менее чем в 150 интерфазных ядрах. Этот параметр выражали в пикселях (px - условная единица площади экрана монитора, используемая нами для оценки размеров проецируемых с микроскопа изображений).
Нерадиоактивная флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Использовали зонд на при-центромерный локус 1-й хромосомы (1q12). Его наносили на препарат и под покровным стеклом проводили денатурацию ДНК 7 мин при 74°С в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Ре-натурацию осуществляли во влажной камере при 42°С в течение ночи. После этого стекла выдерживали 7 мин при 42°С в растворе, содержащем 2-кратный стандартный солевой раствор (SSC) и
50%-ный формамид, затем в течение 5 мин при той же температуре в растворе SSC 2-кратной концентрации и 1 мин в 0.1 моль/л Na-фосфатном буфере (рН 8), содержащем 0.1% твин-20 (буфер А). На стекла наносили авидин-флюоресцеинизо-тиоцианат (FITC) в буфере А и препараты инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С, после чего отмывали 2 раза по 10 мин тем же буферным раствором. Далее наносили на стекла раствор пропидиум йодида и диаминофе-нилиндола (DAPI), препараты накрывали покровными стеклами и фотографировали под микроскопом.
Анализ изображений. Для сканирования изображения клеток использовали микроскоп "Axio-plan" ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Перевод двумерного (2D) изображения в 3-мерное (3D) осуществляли с помощью разработанного в лаборатории алгоритма. Определение параметров клеток проводили с использованием компьютерной программы анализа изображений ("Интер-ЭВМ", Москва). Данные представляли в виде гистограмм частотного распределения гибридизац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.