научная статья по теме CТPУКТУPНАЯ ОPГАНИЗАЦИЯ ФОCФОЛИПИДНОЙ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНЫX МЕМБPАН STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS ПО ДАННЫМ ДИФPАКЦИИ НЕЙТPОНОВ Биология

Текст научной статьи на тему «CТPУКТУPНАЯ ОPГАНИЗАЦИЯ ФОCФОЛИПИДНОЙ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНЫX МЕМБPАН STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS ПО ДАННЫМ ДИФPАКЦИИ НЕЙТPОНОВ»

БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.4, с.668-674

== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =

УДК 577.352.348+538.9

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФОСФОЛИПИДНОЙ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН БШрготусеБ hygroscopicus ПО ДАННЫМ ДИФРАКЦИИ НЕЙТР ОНОВ

© 2009 г. М.А. Киселев, Е.В. Ермакова, С.Н. Филиппова*, Н.А. Сургучева*, С. Данте**, Т. Хаус**, В.Ф. Гальченко*

Лаборатория нейтронной физики им. И.М. Франка, Объединенный институт ядерных исследований, 141980, Дубна Московской области, ул. Жолио-Кюри, 6;

*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 2;

**Берлинский центр нейтронного рассеяния, Институт Xана и Майтнер, Германия, 0-14109, Берлин, Глиникер штрассе, 100 Поступила в р едакцию 06.11.08 г.

Методом дифракции нейтронов на многослойных ориентированных липидных мембранах определены наноструктурные параметры мембр аны актинобактер ий. Установлено, что период повторяемости частично гидратированной мембр аны, построенной на основе фосфолипидной фракции клеточных мембран 81гер1отусвз Ьу^тоъсоркиъ, составляет 85,8 ± 0,5 К при Т = 20°С и уменьшается до 83,5 ± 0,5 К при Т = 40°С. Часть липидов не входит в состав бислоя и образует жидкую мицеллярную фазу с размерами мицелл 54,2 ± 0,2 К.

Ключевые слова: липидная мембрана, Streptomyces Ъу^то&сор[сш, актинобактерии, дифракция нейтронов.

Клеточная мембрана прокар иотических организмов играет важную роль в процессах их адаптации к условиям окружающей среды. В последнее время интенсивно изучаются клеточные мембр аны актинобактерий, в частности, стрептомицетов - одной из многочисленных групп спорообразующих мицелиальных прока-риотических микроорганизмов, отличающихся большим адаптационным потенциалом и биотехнологической значимостью. Особенности роста и развития этих организмов, а также ультраструктурная организация обеспечивают возможность их существования в широком ареале почвенных экосистем [1,2].

Способность к выживанию и адаптационные возможности бактер ий во многом определяются структур ной и функциональной организацией их клеточных мембран. Цитоплазма-тическая мембрана (ЦПМ) актинобактерий, как и других бактерий, представляет собой белко-во-липидный комплекс, в основе которого лежит бислойная система, состоящая из полярных и заряженных липидов. Ключевая роль в стр ук-

Сокращения: ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин, SC - Stratum corneum.

турной организации мембран принадлежит фос-фолипидам, физико-химическое состояние и пр остранственная организация которых во многом определяют биологические функции мембран. Липидный со став стрептомицетов хорошо изучен [3]. Среди фосфолипидов преобладают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозит и кардиолипин (табл. 1) [4,5]. Установлена регулято рная роль кардиолипина в функционировании трансмембраннного переноса ионов К + и С а+2 у стр ептомицетов [6]. Важным этапом в изучении свойств липидного бислоя клеточных мембран является определение их наноструктур ы.

В настоящее время разработан целый ряд методов, позволяющих определить основные структурные параметры как искусственных, так и нативных мембр ан. Наноструктура многослойных липидных мембран, образованных синтетическими насыщенными и ненасыщенными липидами, хорошо изучена методами дифракции нейтронов и рентгеновских лучей [7-11], что позволяет лучше понимать принципы организации и функционирования биологической мембраны.

Основными липидами, используемыми при исследованиях модельной мембраны эукариот, яв-

ляются димирисгоилфоефатидилхолин (ДМФХ), дипальмитоилфосфатидилхолин и пальмитоило-леоилфосфагидилхолин [12]. В последнее время с применением метода малоуглового рассеяния нейтронов были получены принципиально новые знания о структуре однослойных фосфолипидных мембран и зависимости толщины липидного бис-лоя от его кривизны [13]. Метод дифракции нейтронов имеет определенное преимущество перед дифракцией рентгеновских лучей, поскольку позволяет применять вариацию плотности длины рассеяния нейтронов за счет замещения Н2О на D2O. По этой причине исследование структуры липидных мембран начиналось с применения метода дифракции нейтронов на ориентированных многослойных мембранах. Затем были использованы методы малоугловой и шир окоугловой дифракции на многослойных липидных везикулах (липосомах) в избытке воды [12] и методы малоуглового рассеяния нейтронов на однослойных везикулах [13,14]. В настоящее время наиболее мощным инструментом исследования наноструктуры однослойной липидной мембраны является комбинированное пр именение малоуглового рассеяния и рефлек-тометрии как нейтронов, так и рентгеновских лучей [15,16]. П ри этом пр инципиально важно, что получение структурной информации из спектров малоуглового рассеяния или рефлек-тометрической кривой невозможно без наличия предварительных сведений о структуре липидного бислоя, которые получаются наиболее дос-товер но из нейтронных дифракционных экспериментов.

Сложной задачей является определение структуры многокомпонентных липидных систем, выделенных из биологических мембран. Например, многочисленные исследования структуры биологических мембран верхнего слоя кожи не дали значительных результатов, пока исследуемые системы не были упрощены до главных компонент. В отличие от однослойной плазматической мембраны, многослойная липидная матрица верхнего слоя кожи млекопитающих (stratum corneum - SC) является наиболее подходящим объектом для исследований дифракционными методами. Основными компонентами липидной матр ицы SC являются це-рамиды, жирные кислоты, холестерин и его пр оизводные. Нейтронные и синхротр онные дифракционные эксперименты на нативных мембранах SC позволили доказать многослойность липидной матрицы [17], а также определить

o

пер иод повторяемости мембраны (57 A) для липидной матрицы кожи поросенка и наблюдать его увеличение до 62,8 A при гидратации [18]. В настоящее время для уточнения данных

Таблица 1. Фосфолипидный со став S. hygroscopicus [4,5]

Фосфолипиды

% от суммарного количест-_ва фосфолипидов_

Данные по [4] Данные по [5]

Кардиолипин

Ф о сфатидилэтанол-амин

Ф о сфатидилглице-рин

Ф о сфатидилино зит Ф о сфатидилино зит-маннозид Лизофосфатидил-

этаноламин Лизокардиолипин

Дилизокардиоли-пинфосфатидилино-зит

Фосфатидилсерин Фосфатидная кислота

20,0 55,0

4,0

< 1

6,0

6,0

Примечание. « - » - Нет данных.

о наностр уктуре липидной мембр аны БС, предсказания ее диффузионных свойств, определения роли отдельных классов церамидов в организации наноструктуры липидной матрицы БС ведутся дифракционные исследования как на синхротронных, так и на нейтронных источниках [13,19]. Комбинир ованное исследование нативных и модельных мембран БС позволило сформулировать физико-химические основы организации наноструктуры липидной матрицы верхнего слоя кожи [20]. Таким образом, выделение из нативной биологической мембраны главных компонент и создание на их основе модельных мембран является существенным дополнением к исследованию нативных форм.

В данной работе представлены первые экс-пер иментальные результаты, полученные методом дифракции нейтронов на многослойных липидных мембранах, построенных на основе фосфолипидной фракции, выделенной из акти-нобактерий Streptomyces Ъу%го5сор1ст (5. Ъу%-тоъсорсш). Для сравнения приводятся результаты нейтр онных исследований липидной многослойной мембраны ДМФХ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали типовой штамм актинобактерий Strepto-

Рис. 1. Спектр малоуглового и дифракционного р ассеяния нейтр онов от многослойной мембр аны, образованной нативными фосфолипидами S. Ьу%-Ю8сор1ст (сплошная линия) при Т = 20°С (ЯН = 97%) и фон от пустой камер ы (пунктир ная линия).

myces hygroscopicus RIA 1433 (= ISP 5578 = АТСС 27438).

Для получения биома ссы культур у выр ащи-вали в погруженны x условиях на качалках (180 об/мин) пр и Т = 28°С в течение 4 сут в жидкой питательной ср еде следующего со става (в %): глюкоза - 1; пептон - 0,4; др ожжевой экстр акт -0,4; MgSO4 - 0,05; КН2РО4 - 0,2; К2НPО4 -0,4. Мицелий собирали центрифугированием, пр омывали 0,3 М р аствор ом сахар озы.

В качестве лизирующего агента использовали лизоцим марки Б Олайнского завода («Реахим», РФ) в концентрации 4-5 мг/мл. Ф р акцию мембр ан получали пр и действии ли-зоцима в гипотонической ср еде (клетки р есус-пендировали в буфере, содержащем 10 мM трис-HCl, 1 мM ЭДТА и 1 М MgCl2) при 37°С, на качалке в течение 1 ч. После этого добавляли ДНКазу и РНКазу до конечной концентр ации 10 мкг/мл. Мембранную фракцию получали ультрацентрифугированием при 22000 g в течение 30 мин на центрифуге Весктап.

Липиды из мембранной фракции выделяли по методу, описанному в работе [21]. Для преимущественного выделения фосфолипидов использовали 2-кратную последовательную экстр акцию смесями ра створ ителей хло р офор м/ме-танол/0,3% Nad в соотношениях 9/10/3 и 5/10/4. Экстр акты объединяли и упар ивали до суха. Осадок обр абатывали смесью хлор офор ма + 0,3% Nad, нижний слой отделяли и концентрировали. Из концентрированного раствора фосфолипиды осаждали ацетоном [22].

Нативные фо сфолипиды р астворяли в хло-роформ-метанольной смеси (1/1). Полученный 1%-й ра створ выливали на квар цевую подложку

Spectrosil 2000 (Saint-Gobain, Германия) р азме-р ом 6,4 х 2,5 см и и спа р яли п р и 40°С. О статки о р ганического ра створ ителя удаляли путем помещения обр азца в фор вакуум на тр и часа.

ДМФХ был любезно предоставлен кампанией Lipoid (Москва). Обр азец из ДМФХ пр и-готавливали, как описано ранее в работе [23].

Эксперимент по дифр акции нейтр онов на ориентированных многослойных мембранах ак-тинобактер ий и ДМФХ выполнен на дифр ак-тометре VI в Институте Xана и Майтнер в Берлине. Дифр актометр VI расположен на хо -лодном источнике водо-водяного стационар но-го р еакто р а BER-II. Длина волны нейтр онов

со ставляла 5,23 A, а расстояние обр азец-детек-тор - 102,38 см. Регистр ацию спектр ов пр ово-дили двумерным позиционно-чувствительным 3Не-детекто р ом площадью 20 х 20 см и разр е-шением 1,5 х 1,5 мм. Дифр акционные спектр ы от много

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком