ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 1, с. 114-120
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ДЕГИДРИНЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ФОРМИРОВАНИЕМ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ БЕРЕЗЫ ПЛОСКОЛИСТНОЙ © 2014 г. А. Г. Пономарев, Т. Д. Татаринова, А. А. Перк, И. В. Васильева, В. В. Бубякина
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологических проблем криолитозоны
Сибирского отделения РАН, Якутск Поступила в редакцию 28.12.2012 г.
Впервые изучены сезонные изменения содержания дегидринов в почках березы плосколистной (ВвШарЫуркуПа Sukacz.), произрастающей в экстремально холодных климатических условиях Восточной Сибири (Центральная Якутия), с помощью ДДС-электрофореза в ПААГ и иммуноблот-тинга. Обнаружены несколько полипептидов, включая предполагаемые запасные белки, содержание которых было выше зимой по сравнению с их содержанием в другие периоды года. Во время периода покоя у растений установлен внутривидовой полиморфизм дегидринов. При этом выявлены две группы дегидринов: дегидрины с мол. м. 56-73 кД, которые обнаруживались круглогодично, но их содержание снижалось летом, и дегидрины с мол. м. 15-21 кД, очевидно, связанные с формированием морозоустойчивости, поскольку они отсутствовали летом и имели высокий уровень зимой. При низких зимних температурах максимальный уровень дегидринов совпадал с минимальным содержанием воды в почках, что сопровождалось повышением морозоустойчивости растений до максимальных значений.
Ключевые слова: ВвШ1а platyphylla — криолитозона Якутии — морозоустойчивость — дегидрины — сезонная динамика — внутривидовой полиморфизм
Б01: 10.7868/80015330313060092
ВВЕДЕНИЕ
Растения Якутии способны выживать в условиях экстремально низких температур и летней засухи. Резко континентальный климат региона характеризуется большими амплитудами колебания абсолютных максимумов и минимумов температур, которые достигают 99-104°С; при этом зимняя температура может доходить до -68°С [1, с. 95]. Такая суровость климата является уникальной для всего Северного полушария, что также определяет редкую встречаемость древесных растений среди жизненных форм Севера.
Береза плосколистная (ВвШ1а platyphylla Sukacz.) является основным лесообразующим лиственным видом в Центральной Якутии. Она занимает примерно 2% лесопокрытой территории Якутии и участвует вместе с хвойными видами в формировании экосистем, стабилизирующих мно-голетнемерзлые грунты. Адаптационный потенциал березы не уступает таковому лиственницы Каяндера (Ьагтх еа]апйеп Мауг) — самому морозоустойчивому в мире древесному виду, доминанту
Адрес для корреспонденции: Пономарев Анатолий Гаврилье-вич. 677980 Якутск, пр-т Ленина, 41. Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН. Электронная почта: anaponomarev@yandex.ru
восточно-сибирской тайги [2]. Вместе с данным видом береза проникает на самый север Евразии. Ее экологическая пластичность непосредственно связана с генетическим полиморфизмом, наблюдаемым также и на уровне полиморфизма ряда белков [3, с. 3—5, 149], создающим мобилизационный резерв вида, обеспечивая оптимальную приспособленность отдельных популяций в каждый конкретный момент времени.
Развитие морозоустойчивости древесных растений запускается коротким фотопериодом и низкой температурой. Холодовая акклимация растений ассоциируется со специфическими генами, индукция экспрессии которых приводит к изменению метаболизма и физиологических функций, затрагивая уровни фитогормонов и ан-тиоксидантов, осмолитов и защитных белков, в том числе и шаперонов, а также белков с неизвестными пока функциями [4, 5]. Среди защитных белков повышенный интерес вызывают де-гидрины, которые представляют собой группу II белков позднего эмбриогенеза. Они накапливаются в тканях растений в ответ на осмотический стресс, вызванный дефицитом воды, низкой температурой и высокой засоленностью [6, 7].
Дегидрины представляют собой высокогидрофильные белки, которые содержат консервативные К-, Y- и S-сегменты [8]. Эксперименты in vitro показали, что дегидрины выполняют множество функций (шаперонную, криопротекторную, ан-тифризную, радикал-собирающую, ион-связыва-ющую) [7]. Есть также прямые свидетельства о защитной роли дегидринов [9]. Исследования древесных растений умеренных зон показали, что у них содержание дегидринов является высоким в течение зимы и низким в течение активного роста. Предполагается, что дегидрины участвуют в защите клеток у зимующих деревьев, когда идет отток воды из цитоплазмы и формируется экстраклеточный лед [5]. Дегидрины могут быть использованы в качестве непрямых стресс-маркеров, в том числе и маркеров морозоустойчивости [7]. Ряд дегидри-нов, выделенных из отдельных органов березы, мы идентифицировали ранее [10, 11].
Целью настоящей работы явилось выявление особенностей внутривидового полиморфизма и сезонной динамики дегидринов, ассоциированных с формированием криотолерантности почек — наиболее устойчивого органа B. platyphylla в уникальных климатических условиях Центральной Якутии. Такие исследования растений криолито-зоны Евразии ранее не проводились.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор полевых материалов осуществляли в 2009 г. ежемесячно на постоянных пробных площадях в лесопарковой зоне на территории Ботанического сада Института биологических проблем криоли-тозоны СО РАН, расположенного на второй надпойменной террасе долины р. Лены в 7 км к западу от Якутска (62°15' с.ш., 129°37' в.д.). Возраст берез — 40—50 лет. Использовали почки березы плосколистной (Betula platyphylla Sukacz.), собранные в первой половине дня. Показатели климата были близки к значениям, наблюдаемым в Центральной Якутии в последние десятилетия. Средняя температура воздуха за май-сентябрь 2009 г. составляла 14.2°С, сумма осадков — 142 мм. Минимальная зарегистрированная температура достигала -44°С (февраль).
У растений, отмеченных как Ya3, Ya4 и Ya6, была подробно изучена сезонная динамика белков. Для исследования полиморфизма дегидринов образцы собирали в ноябре с 14 индивидуальных деревьев (Ya1—Ya14).
Для выделения суммарных белков почки березы (1.5 г) измельчали в ступке в жидком азоте в присутствии нерастворимого поливинилпирро-лидона (2.5 % по отношению к объему буфера; "Serva", Германия) и буфера (20 мл), содержавшего 0.1 М Трис—HCl, рН 7.5, 12 мМ 2-меркаптоэта-нол, 1% ДДС, 10 мМ ЭДТА, 3 мМ фенилметил-
сульфонилфторид [12]. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 50000 g. К супернатанту, профильтрованному через капроновую ткань, добавляли поливинилпирролидон (2.5%) и снова центрифугировали 20 мин при 50000 g. Все процедуры проводили при 4°С. Белки осаждали пятью объемами ацетона при -20°С. Содержание белка определяли методом Lowry с соавт. [13] с помощью набора ("Bio-Rad", США). Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ с ДДС [14] с использованием маркеров молекулярной массы ("Fermentas", Литва) и последующим окрашиванием белков Кумасси R-250. На треки наносили равное количество белка (15 мкг). Белки из ПААГ переносили на ПВДФ (поливинилиденфторид) мембрану ("Bio-Rad"). Данные сканирования мембран обрабатывали с помощью программы ImageJ 1.41o/Java 1.50_09 (США).
Дегидрины идентифицировали с помощью поликлональных антител против их консервативного К-сегмента в разведении 1 : 500 ("Agrisera", Швеция). Дегидрины визуализировали при помощи антикроличьих антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой в разведении 1 : 2500 ("Sigma", США). В качестве хромогенных субстратов использовали 5-бромо-4-хлоро-3-индо-лилфосфат и нитротетразолий синий ("Appli-Chem", Германия).
Содержание воды в почках определяли взвешиванием после сбора образцов (свежая масса, FW). Сухой вес (DW) оценивали после высушивания тканей при температуре 105°C до постоянного веса. Содержание воды вычисляли по формуле:
[(FW - DW)/FW] х 100%.
На рис. 4 представлены средние значения (n = 3) и их стандартные ошибки.
Температуру воздуха в районе Якутска отслеживали по сайту URL http://www.wunderground.com.
Эксперименты проводили в трехкратной биологической повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При сравнении 14 экземпляров B. platyphylla берез выявили полиморфизм дегидринов в период покоя растений (рис. 1). Были идентифицированы две группы дегидринов. В первую группу объединили дегидрины с низкими мол. м. — 1521 кД; ко второй группе отнесли дегидрины с мол. м. в области 56-73 кД. Дегидрин с мол. м. 17 кД в достаточном количестве представлен у всех исследованных берез; другой мажорный дегидрин (18 кД) встречался у 5 экземпляров. Более редкими являлись 15 и 21 кД-дегидрины. Относительно высокомолекулярные дегидрины имели множество форм (не менее 15). Причем мажорные 66 и 69 кД-дегидрины были выявлены у большинства
кД 11666.2
45 35
25
18.414.4
кД
11666.2
45 35
25
18.4 14.4
кД
73
56
21
18 17
15
Ya1 Ya2 Ya3 Ya4 Ya5 Ya6 Ya7 (б)
кД
73 56
21
18 17
15
Ya8 Ya9 Ya10 Ya11 Ya12 Ya13 Ya14
Рис. 1. Спектры дегидринов в почках В. platyphylla в период покоя (ноябрь 2009 г.).
а — березы Ya1-Ya7, б — березы Ya8-Ya14. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на ПВДФ (поливинилиденфторид) мембрану. Дегидрины обнаружены с помощью антител, полученных против консервативного К-сегмента. Слева указаны молекулярные массы стандартов, справа — молекулярные массы дегидринов.
берез, тогда как другие мажорные белки — лишь у отдельных экземпляров.
Для того, чтобы выявить связь дегидринов с морозоустойчивостью растений, необходимо бы-
ло изучить их сезонную динамику. Мы проанализировали образцы с трех растений — Ya3, Ya4, Ya6 (рис. 2). Дегидрины березы Ya3 обладали более высокой вариабельностью в низкомолекулярной области. Найдены мажорные 17, 18, 21 кД-дегид-рины и минорный 15 кД-дегидрин. Меньшим полиморфизмом в этой области характеризовались березы Ya4 и Ya6, у которых был выявлен только мажорный 17-кД дегидрин. Среди более высокомолекулярных полипептидов зимой у всех берез идентифицировали дегидрин с мол. м. 69 кД, у берез Ya3 иYa6 — 66 кД-полипептид.
Общие особенности сезонной динамики можно сформулировать как падение уровня дегидри-нов после выхода растений из покоя (период набухания почек), их минимальное содержан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.