научная статья по теме ДЕЛЕНИЕ МЕМБРАННОЙ НАНОТРУБКИ, ВЫЗВАННОЕ ОСМОТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ Биология

Текст научной статьи на тему «ДЕЛЕНИЕ МЕМБРАННОЙ НАНОТРУБКИ, ВЫЗВАННОЕ ОСМОТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 308-313

УДК 577.352

ДЕЛЕНИЕ МЕМБРАННОЙ НАНОТРУБКН, ВЫЗВАННОЕ ОСМОТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ

© 2008 г. А. И. Евсеев, П. В. Башкиров

Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 31; электронная почта: pashokb81@mail.ru Поступила в редакцию 20.02.2008 г.

Завершающим этапом эндоцитоза является деление тонкого мембранного перешейка, или нано-трубки (НТ), связывающего плазматическую мембрану с образующейся везикулой. Этот процесс изучался нами на модельной системе, представляющей собой мембранную НТ, вытянутую из плоской бислойной липидной мембраны. Деление мембранной НТ производилось с помощью приложения осмотического давления. Оно создавалось подведением к НТ пипетки с концентрированным раствором соли. Использование дистиллированной воды вместо концентрированного раствора соли приводило к расширению НТ, из чего можно сделать вывод об обратимости процессов расширения-сжатия НТ под действием осмотического давления. Показано, что общая картина деления сходна с таковой, наблюдавшейся ранее при делении НТ с участием GTP-азы динамина. А именно, в обоих случаях для деления НТ ее необходимо сжать до критического радиуса. Полученная величина критического радиуса превышает значение, полученное при белковом делении. Деление под действием осмотического давления, так же как деление с участием динамина, не сопровождалось появлением проводящих дефектов.

Деление мембран лежит в основе многих ключевых процессов жизнедеятельности клетки. Так, при эндоцитозе плазматическая мембрана соединена с формирующейся везикулой узким перешейком. В результате деления этого перешейка, осуществляемого рядом белков, везикула оказывается в цитоплазме. Ключевую роль в этом процессе играет GTP-аза динамин [1]. Другой пример - это деление мембран в процессе функционирования эндоплазматического ретикулума или аппарата Гольджи, необходимое для формирования везикул-переносчиков, выполняющих транспортные и секреторные функции [2, 3]. Однако, несмотря на всю биологическую значимость процесса деления мембранных структур, о его молекулярном механизме, о роли в нем белков и липидов известно мало. A priori считают, что при делении сохраняется замкнутость объема делящейся структуры. Для ряда частных случаев это предположение нашло экспериментальное подтверждение. Так, было показано, что без образования проводящих дефектов происходит как отщепление везикул от мембраны под воздействием белков COP-комплекса [4], так и деление мембранной нанотрубки (НТ) белком ди-намином [5]. В работе [5] было выявлено, что деление происходит только после сжатия НТ до критического радиуса внутреннего просвета r*, который составляет примерно 2-3 нм. Значительный прогресс в теории деления мембран был достигнут в работах М. Козлова и И. Козловского [6, 7]. Первая из них была посвящена делению НТ динами-ном. В ней были найдены условия, при которых возможно локальное сжатие вплоть до обращения

в ноль радиуса внутреннего просвета НТ. Это событие ассоциировалось с делением. Однако заключительная стадия деления - изменение топологии НТ и ее сегрегация на отдельные везикулы - не была рассмотрена. В работе [7] авторы рассмотрели деление узкого перешейка между клеточной мембраной и везикулой, происходящее при участии белков комплекса СОР. При этом предполагалось, что интермедиат деления возникает в результате полуслияния внутренних монослоев перешейка. Тем самым этот механизм обеспечивает деление, не сопровождающееся утечкой. Перезамыкание мембран в этой модели начинается после того, как перешеек сжимается настолько сильно, что его радиус достигает критического значения. Таким образом, общей чертой, присущей различным теоретическим моделям и целому ряду экспериментальных систем, включая НТ с адсорбированным динамином, является наличие критического радиуса внутреннего просвета НТ (или перешейка), после достижения которого происходит деление.

Целью данной работы было показать, что эта закономерность носит универсальный характер и не зависит от того, каким именно способом происходит сжатие НТ. В связи с этим мы провели исследование деления чисто липидной НТ, сжатие которой создавалось осмотическим давлением.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методика формирования НТ подробно описана в работе [8]. Мембранную НТ с помощью стеклянной микропипетки вытягивали из плоской бислой-

пэтч-кламп усилитель

БЛМ

пэтч-кламп усилитель

БЛМ

пэтч-кламп усилитель

БЛМ

пэтч-кламп усилитель

БЛМ

Рис. 1. Схема формирования мембранной нанотрубки. а - Сетка, в отверстиях которой сформировались липидные би-слои, находится в растворе электролита. • - Формирование плотного контакта между пэтч-пипеткой и БЛМ с последующим разрушением мембраны под пипеткой. в - Формирование мембранной катеноидальной микротрубки в начале отведения пипетки от плоской БЛМ. г - Образование мембранной НТ в результате коллапса микротрубки.

ной липидной мембраны (БЛМ) в растворе электролита (рис. 1а-г). Располагающийся в стеклянной микропипетке хлорсеребряный электрод позволял проводить измерения проводимости внутреннего канала НТ. В работе [8] БЛМ формировали методом Рудина-Мюллера на 100 мкм отверстии в те-флоновой пленке. В нашем случае использовалась не тефлоновая пленка, а медная сетка, обычно применяемая в электронной микроскопии (рис. 1а). Она крепилась к корпусу ячейки. На сетке можно было сформировать множество мембран и использовать их в процессе эксперимента. Это очень удобно, так как при прорыве мембраны ее не нужно формировать заново, а можно перейти к другой. Ячейка была полностью утоплена, что уравнивало гидростатическое давление между верхней и нижней сторонами БЛМ. Пэтч-пипетка подводилась вплотную к БЛМ до установления плотного контакта, а затем мембрана под пипеткой прорывалась (рис. 16). Отведение пипетки приводило к формированию микротрубки в форме катеноида (рис. 1в), который при увеличении длины терял стабильность и "схлопывался" в НТ (рис. 1г). Равновесный радиус (г) получаемых таким образом НТ определяется исключительно механическими параметрами липидного бислоя - его модулем из-гибной жесткости и латеральным натяжением [9].

Значение радиуса г находилось из анализа экспериментально полученной зависимости проводимости нанотрубки О1 от ее длины I [10].

О, пСм

11 12 13 14 15 16 17

Ь, мкм

Рис. 2. Аппроксимация гиперболической функцией зависимости измеряемой проводимости О от положения кончика пэтч-пипетки Ь. Точки соответствуют дискретным моментам регистрации О и Ь. Сплошной линией изображена аппроксимирующая функция, построенная по формуле (2). В результате аппроксимации найдены следующие значения параметров: р1 = 98 пСм/мкм, р2 = 11 мкм, р3 = 37 пСм.

Предполагалось, что НТ представляет собой цилиндр, заполненный электролитом. Проводи-

Рис. 3. Схема эксперимента по делению НТ с помощью осмотического давления. а - В ячейку вводится пипетка с 1 М KCl. б - Пипетка с 1 М KCl приближается к НТ. в - После сжатия НТ происходит ее деление.

r, нм 8

7

6

5

10

100

1000 [KCl], мМ

Gt =

nr

p l'

(1)

водимости G от длины L аппроксимировалась гиперболической функцией вида

G

_ Р1

+ p3,

(2)

Ь - р 2

где параметр р1 связан с радиусом внутреннего просвета НТ как

л п r

Р 1 = У

(3)

Рис. 4. Радиус НТ, измеренный при различной концентрации KCl в растворе.

мость Gt такого цилиндра зависит от его длины l как

где р - удельное сопротивление раствора электролита. Измеряемая в эксперименте проводимость О включала в себя не только проводимость НТ, но и проводимость р3, связанную с электрической утечкой в месте контакта мембраны и стеклянной пипетки, т.е. О = О1 + р3. Длина нанотрубки I равна разности между величиной подъема микропипетки относительно ее самого нижнего положения Ь и расстоянием р2 между плоской БЛМ и самым нижним положением кончика пипетки, т.е. I = Ь - р2. Получаемая в ходе эксперимента зависимость про-

На рис. 2 приведены результаты измерения проводимости G в зависимости от L и аппроксимирующая их функция, построенная по формуле (2). Это сделано на примере НТ, процесс деления которой показан на рис. 5а. Из уравнения (3) находили радиус просвета НТ r, определив параметры p1, p2, p3 с помощью аппроксимации функцией (2) экспериментально получаемой зависимости проводимости G от длины L. Для используемого в экспериментах липидного состава БЛМ (смесь 1,2-диолеоил-,от-глицеро-3-фосфохолина (ДОФХ), 2-диолеоил-,от-глицеро-3-фосфоэтаноламина (ДОФЭ) и холестерина ("Avanti Lipids Inc.", США) в соотношении 2:1 с добавлением 20% холестерина) радиус внутреннего просвета НТ составлял около 6 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Последовательность операций в опытах по делению НТ выглядит следующим образом. Для сжатия НТ к ней прикладывали осмотическое давление, которое создавали за счет разности концентраций хлорида калия внутри и снаружи НТ посредством пипетки, заполненной раствором 1 М KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.0 (рис 3а). Пипетку подводили к НТ так, что расстояние от ее кончика до НТ составляло 50-100 мкм, диаметр кончика равнялся 10-20 мкм; одновременно с этим регистрировали изменение проводимости G. Разница гидростати-

4

G' 1.2

0.8

0.4

G*

t

0

Gt 1.2

0.8

Gt*

t

0.4

'i

5 10 15

г л

м в

\ ^НмММИУмы ^

1 1

0.4

Gt

20 0

t, с

G'

1.2

10

0.4

Gt

10

15

20

25 t, с

15 0

t, с

10

15

20

t, с

Рис. 5. Примеры изменения во времени нормированной проводимости после приложения осмотического давления. Стрелкой 1 отмечен момент, когда начинается падение проводимости, вызванное уменьшением радиуса просвета НТ. Стрелкой 2 отмечен момент деления НТ. С* - уровень нормированной проводимости непосредственно перед актом деления.

ческого давления на границе кончика пипетки с раствором равнялась нулю, так что концентрация KCl около НТ увеличивалась только за счет диффузионных потоков. В ходе эксперимента НТ фиксировалась на определенной длине порядка 1 мкм. Пипетка с 1 М KCl подводилась сверху с помощью микромотора, ее положение в горизонтальной плоскости регулировалось микровинтами. Это приводило к сжати

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком