научная статья по теме ДЕНАТУРАЦИЯ МОНОСЛОЕВ КОЛЛАГЕНА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ВОДА–ВОЗДУХ: МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА Биология

Текст научной статьи на тему «ДЕНАТУРАЦИЯ МОНОСЛОЕВ КОЛЛАГЕНА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ВОДА–ВОЗДУХ: МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 142-154

УДК 577.322.72

ДЕНАТУРАЦИЯ МОНОСЛОЕВ КОЛЛАГЕНА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ВОДА-ВОЗДУХ: МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА

© 2008 г. А. С. Фадеев1' 2, Г. П. Ямпольская2, С. М. Левачев2, С. Ю. Зайцев1

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина, ветеринарно-биологический факультет, кафедра органической и биологической химии, 109472 Москва,

ул. Академика Скрябина, 23, электронная почта: afadee2002@yahoo.co.uk, szaitsev@mail.ru; 2 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет, кафедра

коллоидной химии, 119991, Москва Поступила в редакцию 27.08.2007 г.

Изучены монослои фибриллярного белка коллагена на границе раздела фаз вода-воздух в присутствии мочевины и тиомочевины в субфазе. Основной особенностью монослоев коллагена на границе раздела вода-воздух является способность к образованию надмолекулярных структур (фибрилл), которые в свою очередь также образуют монослой со своей точкой коллапса. Из-за этого в п-А изотермах монослоя коллагена существуют два "квазилинейных" участка, разделенные плато, т.е. жидко-растянутое и жидко-конденсированное состояния, что отличает монослои коллагена от других белков. Показано, что в монослое коллаген проходит через те же стадии структурной организации, что и в объеме. Свойства монослоев коллагена быстро и необратимо изменяются в присутствии денатурирующих добавок по сравнению с монослоем на чистой воде. Тиомочевина оказывает на монослои коллагена значительно более сильное денатурирующее действие, чем мочевина. Эти изменения возрастают с увеличением концентрации денатуранта и времени выдерживания монослоя. Нами предложен механизм, описывающий денатурирующее действие тиомочевины на фибриллярные белки, заключающийся в гидрофобном взаимодействии группы C=S тиомочевины с неполярными участками на поверхности белка и последующей переориентации карбонильных групп белка на образование водородных связей с КИ^-группами тиомочевины и разрывом собственных водородных связей.

Образование монослоя на поверхности водных растворов характерно для большинства белков, несмотря на хорошую растворимость многих из них в воде [1, 2]. При осторожном нанесении коллоидного раствора белка на водную подложку образуются устойчивые монослои, обратимо сжимаемые до определенного двумерного давления, величина которого зависит от свойств белка. Изотермы двумерное давление (п, мН/м) - площадь на молекулу (А, нм2) имеют много общих черт (невысокие значения давления коллапса монослоев, большие площади на молекулу белка и т.д.) для большинства белков, отличающих их от монослоев липи-дов. Однако подавляющее большинство работ (более 90%) выполнено с глобулярными белками. Фибриллярным белкам в монослойных исследованиях уделялось значительно меньше внимания [3, 4]. Фибриллярные белки по своей природе и из-за огромной молекулярной массы очень плохо растворимы в воде, что создает известные трудности при приготовлении растворов для нанесения, но предотвращает десорбцию после формирования монослоя. Монослои фибриллярных белков обычно отличаются большой стабильностью. Заметим, что свойства монослоев классических фибрилляр-

ных белков (коллагена, фиброина) с вытянутыми полипептидными цепями резко отличаются от свойств фибриллярных структур, образованных связанными глобулами из отдельных белковых субъединиц (фибриноген, тубулин). По нашему мнению, основанному на анализе свойств их монослоев, монослои фибриногена и тубулина занимают промежуточное место между истинно фибриллярными и глобулярными белками.

Коллагены - это семейство фибриллярных белков, имеющихся у всех многоклеточных животных, составляющих основу соединительной ткани животных и обеспечивающих ее прочность [5]. Коллаген и коллагеноподобные белки так же широко распространены в животном мире, как целлюлоза в растительном, и составляют около 30% (по массе) всех белков организма животных. Они образуют основную массу соединительной ткани и входят в состав ее главных компонентов: фибробластов, межклеточного вещества и волокон [6]. Количество коллагена зависит от типа ткани или органа, возраста, вида, породы и пола животного и находится в прямой связи с функциями, выполняемыми органом в теле животного. Органы, выполняющие преимущественно опорные

функции, богаты коллагеном [7], а выполняющие функции обмена веществ - бедны. Коллаген является важнейшим компонентом соединительной ткани, его главная функция - образование нерастворимых фибрилл высокой прочности [7]. Отдельные трехцепочечные молекулы коллагена называют тропоколлагеном. Хотя каждая полипептидная цепь тропоколлагена, называемая а-цепью, представляет собой спираль, ее периодичность и размеры значительно отличаются от соответствующих параметров а-спирали [8]. Коллаге-новая спираль уникальна и не встречается в других белках. Тропоколлаген представляет собой палочкообразную молекулу длиной 300 нм и толщиной всего 1.5 нм. Он имеет молекулярную массу 270300 кДа в зависимости от типа и степени гликози-лирования и состоит из трех полипептидных а-це-пей. Рентгеноструктурные исследования коллагена показывают, что эти а-цепи плотно скручены в виде "трехжильного каната" [8]. Полипептидная цепь тропоколлагена образует левую спираль, на один виток которой приходится только три аминокислотных остатка. Поскольку в коллагене присутствует много остатков пролина и гидроксипро-лина, что придает цепи жесткую изогнутую кон-формацию, три спиральные полипептидные цепи плотно обвиты одна вокруг другой [9]. Они соединены между собой также поперечными водородными связями. Роль глицина, занимающего каждое 3-е место в пептидной цепи, состоит в том, что он позволяет трем цепям коллагена сблизиться и, не имея боковой группы, не создает стерических помех в центре спирали. Объемистые группы пролина и гидроксипролина направлены в сторону окружающей среды [8]. Отдельные тропоколлаге-новые молекулы слабо связаны между собой, поэтому in vivo в "разрывах" между ними нередко кристаллизуется фосфат кальция (например, в зубах и костях) [10].

Процесс денатурации белков на границах раздела фаз, в частности в монослоях, изучен мало [11-13]. Известно только, что поверхностная денатурация белков отличается от денатурации в растворе, поскольку двумерное состояние (монослой) способно стабилизировать промежуточные (неустойчивые в объеме) формы белка [14]. Для фибриллярных белков в монослое такие детальные исследования не проводились. Целью данной работы является моделирование процессов денатурации фибриллярного белка коллагена в монослое на границе раздела фаз под действием поверхностно инактивных денатурирующих агентов - мочевины и тиомочевины. Выбор этих денатурантов обусловлен существенным отличием их поверхностной инактивности от более сильных поверхностно-активных веществ (ПАВ) типа SDS, которые могут просто вытеснять коллаген из монослоя полностью при концентрациях, намного ниже требуемых для денатурации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Коллаген. Коллаген типа I (далее коллаген) -выделен из склеры глаза свиньи по описанной ранее методике [15]. Молекулярная масса, определенная методами электрофореза в полиакрила-мидном геле (SDS-PAGE) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составила 285 кДа. Для ВЭЖХ использовали хроматограф Hewlett-Packard 1090 M, параметры колонки 300 х х 7.5 мм, носитель TSK-GEL 3000 SW, объем образца 10 мкл, регистрация компонентов проводилась с помощью диодно-матричного детектора при длине волны 205 нм. Для экспериментов и хранения коллагена использовали его раствор в 0.1 M ацетатном буфере (pH 3.44) с концентрацией 8.6 х 10-6 М. Точную концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [16], оптимизированным специально для коллагена [17, 18]. При проведении серии экспериментов растворы коллагена готовили разбавлением исходного раствора.

Растворы для субфазы. Растворы с требуемой концентрацией мочевины или тиомочевины готовили на основе бидистиллированной воды из реактивов: мочевина ч.д.а. и тиомочевина ч.д.а ("Реа-хим", Россия). Во всех опытах независимо от состава субфазы ее поверхность перед нанесением коллагена очищалась по методике Ленгмюра: субфазу выдерживали в ванне в течение часа, после чего поверхность сжимали и очищали полосками парафинированной бумаги. Эта процедура оказалась необходимой для очистки растворов мочевины и тиомочевины от примесных ПАВ. Перед каждым экспериментом чистоту раствора субфазы контролировали путем снятия контрольных изотерм двумерного давления и при необходимости проводили повторную очистку.

Формирование мономолекулярных слоев коллагена. На поверхность субфазы с помощью микропипетки наносили 20 мкл водного раствора коллагена [15], концентрация которого при получения больших площадей на молекулу тропоколлагена составляла 8.6 х 10-7 М, а при изучении только жидко-конденсированного состояния - 8.6 х 10-6 М. Изотермы перекрывались на значительных участках и совпадали, что позволяло строить обобщенную изотерму сжатия п-A в диапазоне от 3158 до 13.5 нм2 на молекулу. Все опыты проводили при 20°С. До начала измерений обычно проходило около 2 мин, что вполне достаточно для достижения равновесного состояния монослоя. Для исследования мономолекулярных слоев использовали ванну Ленгмюра кругового типа, описанную ранее [15]. Исходная площадь монослоя составляла 327 см2, конечная 14 см2, скорость сжатия 1.59 см2/с. Двумерное давление измеряли с использованием вольфрамовой пластинки Вильгельми, точность измерений ±0.1 мН/м.

Поверхностное давление п, мН/м

Рис. 1. Изотермы сжатия п-A монослоев коллагена на поверхности водных растворов мочевины разной концентрации. а - низкие концентрации, М: 1 - 0, 2 - 0.05, 3 - 0.1, 4 - 0.5, 5 - 1.0; • - высокие концентрации, М: 1 -2.0, 2 - 3.0, 3 - 4.0, 4 - 5.0, 5 - 6.0, 6 - 7.0, 7 - 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Присутствие денатурирующих агентов в субфазе приводит к большим изменениям в белковом монослое [1]. Форма получаемых изотерм п-А позволяет делать выводы о том, как именно нарушается взаимодействие макромолекул белка друг

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком