ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 1, с. 76-80
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ДЕЙСТВИЕ АММОНИЯ НА САХАРОЗОСИНТАЗУ В КОРНЯХ РАСТЕНИЙ ГОРОХА © 2010 г. А. В. Никитин, Р. К. Брускова, Т. М. Андреева, С. Ф. Измайлов
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 22.07.2008 г.
Исследовано действие аммония на активность сахарозосинтазы (СС) растений гороха посевного (Pisum sativum L.). На среде с аммонием (14.2 мМ) в форме (NH4)2SO4 активность СС возрастала в корнях на 20—200% в течение 10—20 суток роста по сравнению с таковой в указанных органах растений, росших на среде без азота. Величина эффекта зависела от освещенности. В условиях естественного освещения действие аммония на активность наблюдали не только при ясной погоде (до 25 клк), но и в пасмурный день (3—6 клк), хотя и в меньшей степени. При стабильно низкой освещенности растений (2.5 клк) аммоний не влиял на активность СС. В опытах in vitro в зависимости от концентрации аммония в реакционной смеси в интервале 0—1 мМ (NH4)2SO4 наблюдали ингибирование ферментативной активности (до 10%), тогда как в диапазоне 1—37.5 мМ активация достигала 50%.
Ключевые слова: Pisum sativum — корни — сахарозосинтаза — аммоний — освещенность
ВВЕДЕНИЕ
Ранее нами было показано, что нитрат, наиболее усвояемый источник минерального азота для растения, может быть сигнальным агентом в активации сахарозосинтазы (СС) растений гороха [1]. Благодаря этому, помимо уже имевшихся доказательств роли нитрата как индуктора экспрессии генов, участвующих в его восстановлении, ассимиляции аммония, ряда ферментов обмена органических кислот (например, ФЕП-карбоксилаза, изоцитратдегидро-геназа, малатдегидрогеназа, аконитатгидратаза, лак-татдегидрогеназа [2, 3]), были получены факты, дающие основание полагать, что указанный ион в сферу позитивной регуляции способен вовлекать и стартовую реакцию углеводного обмена, контролируемую СС. Тем самым, исходно предопределяется возможность активации последующих ферментов углеродного метаболизма на пути наполнения пулов С-метаболитов, необходимых для прямого или ана-плеротического обеспечения углеродом реакций азотного обмена. Такая изначальная перестройка в обмене веществ под влиянием нитрата, связанная с возможным перераспределением углерода на последующий синтез азотсодержащих веществ, отчетливо выражена в корнях — акцепторах транспортной сахарозы [1].
В отличие от нитрата строгие доказательства роли аммония, второго основного источника минерального азота для растений, и/или происходящих
Сокращение: СС — сахарозосинтаза.
Адрес для корреспонденции: Никитин Андрей Валентинович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: nitrogenexchange@mail.ru
от него "downstream" метаболитов как сигнальных молекул, регулирующих стартовые ферменты углеводного метаболизма (инвертаза, СС), практически отсутствуют. Исходя из этого, целью настоящей работы было изучение роли аммония в регуляции активности СС растений гороха в корнях in vivo и in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследований. В работе использованы растения гороха посевного (Pisum sativum L.) сорта Труженик. Семена проращивали в рулоне влажной фильтровальной бумаги при 23—25°С в темноте. В возрасте четырех суток проростки переносили в сосуды с 5 л отстоянной водопроводной воды, по 60 растений на сосуд. В опытах с определением активности СС in vivo по достижении растениями 10-дневного возраста воду в сосудах заменяли на жидкую питательную среду, содержавшую или не содержавшую азот, что являлось вариантами опыта. Питательные среды обновляли каждые двое суток и продували сжатым воздухом. Растения выращивали в оранжерее в разные сезоны года при естественном освещении или в факторостатной камере при 16-часовом фотопериоде с постоянной освещенностью на стеллаже 2.5 клк. В оранжерее этот показатель варьировал от 3.5 до 12 клк в пасмурную и с переменной облачностью погоду и от 12 до 25 клк в ясную погоду в середине дня. Повторность опытов in vivo была двукратной, in vitro — трехкратной.
Питательные среды. В экспериментах in vivo были использованы азотсодержащая (аммонийная) и безазотная питательные среды. Первая представляла собой модифицированную среду Кнопа, содержав-
1.8 г
1.6
л
ч о
М Л
з °
« о _Т св
te sS
Ь о
1.4
1.2
1.0
о д
х Л
§0.6 л
св
S 0.4
0.2
13 17
Возраст растений, сутки
20
Рис. 1. Активность сахарозосинтазы в корнях гороха, росшего при естественном освещении и в зависимости от наличия в питательной среде аммония. Опыты проводили при преобладании дней с ясной погодой во второй половине периода выращивания растений. Точки на графике — результат анализа навески корней (4—5 г), среднее арифметическое из 5 аналитических повторностей. 1 — среда с аммонием (14.2 мМ), 2 — среда без аммония.
шую в качестве источника азота аммоний (14.2 мМ) в форме (МН4)2804. В одном из опытов была использована среда с 1.4 мМ аммонием. Вторая среда не содержала азота. Дефицит калия и кальция в обоих вариантах сред компенсировали внесением солей К2804 и Са804 • 2Н20. Содержание других макросолей Кнопа во всех вариантах питательных сред было одинаковым. Отбор растений для определения активности СС в корнях проводили в возрасте растений 13, 17 и 20 суток. Корневые системы использовали целиком, навеска составляла 4—12 г.
Экстракция и определение активности СС. Выделение препаратов, обладающих ферментативной активностью, и ее определение проводили по использованной ранее методике [4]. Этапы экстракции включали: гомогенизацию навески в среде выделения (75 мМ Трис-НС1-буфер, рН 7.5, 10 мМ 2-мер-каптоэтанол, 5 мМ М§С12), настаивание гомогената в течение 1 ч при 4°С, центрифугирование 20 мин при 15000 g, очистку супернатанта гель-фильтрацией через сефадекс G-25 при центрифугировании. Полученные ферментные препараты хранили в холодильнике на воде со льдом. На следующий день их (15-25 мкл) инкубировали в составе реакционной смеси (0.2 мл), включающей 50 мМ Трис-НС1-бу-
фер, рН 7.5, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 5 мМ MgCl2, 10 мМ D(—)-фрукгозу и 3.12 мМ УДФ-глюкозу, при 37°С в течение 15 мин. Контролем служила реакционная смесь без УДФ-глюкозы. Реакцию проводили в 5 аналитических повторностях. Фермент инакти-вировали 3-минутным нагреванием на кипящей водяной бане. Количество образовавшейся сахарозы определяли методом Roe в модификации Павлино-вой и Прасоловой для микрообъемов [5]. Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили на спектрофотометре Spekol 21 (Германия) при длине волны 520 нм. Активность СС выражали в микромолях сахарозы, синтезированной за 1 мин в расчете на 1 г сырой массы.
В опытах с определением активности СС in vitro, когда изучали действие аммония на уже выделенный препарат, обладающий ферментативной активностью, для экстракции последнего использовали корни 6-дневных растений. В этом случае (NH4)2SO4 вносили непосредственно в реакционную смесь. Интервал концентраций — от 0 до 37.5 мМ. Другие детали экспериментов указаны в разделе РЕЗУЛЬТАТЫ и в подписях к рисункам.
В работе использовали препараты следующих фирм: Sephadex G-25 от "Pharmacia" (Швеция), D(—)-фруктоза от "Merk" (Германия), динатриевая соль УДФ-глюкозы от "Fluka" (Швейцария), 2-мер-каптоэтанол от "Ferak" (Германия), Трис от "Serva" (Германия). Остальные реактивы были отечественного производства, имеющие квалификацию "х.ч." и "ч.д.а.".
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе работы была поставлена задача, изучить действие аммония на СС на фоне сочетания гетеротрофного и автотрофного питания растений азотом, когда они сначала потребляли запасы семядолей, а затем преимущественно азот среды. Для этого были поставлены два вегетационных опыта с растениями, росшими при естественном освещении в условиях оранжереи фитотрона ИФР РАН.
В первом опыте, проведенном в мае, было обнаружено увеличение активности СС в корнях под влиянием аммония по сравнению с таковой у растений, растущих без азота (рис. 1). Оно составляло 80, 150 и 200% на 3-, 7- и 10-е сутки роста после перенесения растений с воды на питательные среды с аммонием или без азота. При этом активность СС в корнях на средах как с аммонием, так и без него уменьшалась с возрастом.
Во втором опыте (сентябрь-октябрь) полученные ранее результаты были в основном подтверждены (рис. 2) с той лишь разницей, что на среде с аммонием наблюдали увеличение эффекта на 7-е сутки после перенесения растений с воды на питательные среды с аммонием или без азота. В данном случае, как и в первом опыте, закономерность действия аммония на СС в корнях оказалась сходной, хотя она
0
2.5 г
л
ч о
М Л
2 ° « о
_т св §
§ &
м л
° и
со ^
О х
X св о
2.0
1.5
1.0
л
т О
р
св X св
и 0.5
-о 2
13 17 20
Возраст растений, сутки
Рис. 2. Активность сахарозосинтазы в корнях гороха, росшего при низкой естественной освещенности и в зависимости от наличия в питательной среде аммония. Опыты проводили при преобладании дней с пасмурной погодой, особенно во второй половине периода выращивания растений. Точки на графике — результат анализа навески корней 4—5 г, среднее арифметическое из 5 аналитических повторностей. 1 — среда с аммонием (14.2 мМ), 2 — среда без аммония.
была выражена в меньшей степени (20—75%). Но в обоих случаях разница между контролем и опытом была явной.
Специфика освещения растений в указанных опытах состояла в том, что они произрастали в естественных условиях и потому зависели от колебаний интенсивности света. Так, например, в первом опыте на 13-е сутки было пасмурно, на 17-е сутки отмечалась переменная облачность, а на 20-е сутки — ясная погода (рис. 1), освещенность колебалась от 12 до 25 клк. Синхронно с этим увеличение активности СС под действием аммония в первом случае было 80%-ным, во втором — 150%-ным, в третьем — 200%-ным. Во втором опыте при общей с первым тенденции влияния аммония на СС некоторое падение активности от 17 к 20 суткам можно объяснить снижением числа солнечных дней, имевшим место в этот период. Таким образом, в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.