ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 222-227
УДК 581.1
ДЕЙСТВИЕ АЗИДА НАТРИЯ ИА ИНДУЦИРОВАННУЮ И БАЗОВУЮ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ ЗасскаготусеБ еегеу181ае
© 2004 г. Е. И. Раченко, Е. Г. Рихванов, Н. Н. Варакина, Т. М. Русалева,
Г. Б. Боровский, В. К. Войников
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук,
Иркутск Поступила в редакцию 05.01.2003 г.
Изучали механизм действия митохондриального ингибитора азида натрия на термотолерантность дрожжей Saccharomyces сегеу1з1ае. Показано, что предобработка азидом натрия при нормальной температуре инкубации повышала термотолерантность дрожжей родительского типа и hsp104 мутанта. В то же время внесение ингибитора во время мягкой тепловой обработки подавляло развитие индуцированной термотолерантности в результате ингибирования индукции синтеза БТШ104. Внесение азида натрия непосредственно перед летальным тепловым шоком приводило к противоположному эффекту на термотолерантность в зависимости от окислительного или бродильного метаболизма дрожжей. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что протекторное действие азида натрия на термотолерантность S. сегеу1з1ае на среде с глюкозой не связано с функционированием БТШ104, а также, что механизмы базовой и индуцированной термотолерантности в дрожжевой клетке существенно различаются.
Saccharomyces сегеу1з1ае - азид натрия - базовая и индуцированная термотолерантность - БТШ104
Кратковременная обработка умеренно высокими температурами индуцирует устойчивость организма к последующему более жесткому температурному воздействию. Это явление, получившее название приобретенная или индуцированная термотолерантность, коррелирует с синтезом белков теплового шока (БТШ), что дало основание предполагать защитную функцию БТШ при тепловом шоке [1]. Получены убедительные доказательства роли Бтш с мол. м. 104 кД (БТШ104) в развитии защитной реакции у дрожжей Saccha-romyces cerevisiae [2]. БТШ104 не препятствовал возникновению повреждений при тепловом шоке, но исправлял их после окончания теплового воздействия [3-5].
БТШ104 S. cerevisiae принадлежит к семейству белков Hsp100/ClpB. Кроме дрожжей, эти белки функционируют у высших растений, но пока не обнаружены у млекопитающих и у человека [6]. Мутанты Arabidopsis thaliana по гену HSP101 (го-
Сокращения: БТШ - белок теплового шока; YEPD - питательная среда для дрожжей (Yeast Extract, Pepton, Dextrosa (глюкоза)).
Адрес для корреспонденции: Рихванов Евгений Геннадьевич. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 07(3952) 51-07-54; электронная почта: eugene@sifibr.irk.ru
молог БТШ104) были неспособны развивать толерантность к летальному тепловому шоку, а обратная трансформация гена дикого типа восстанавливала эту способность. Поскольку ген ШР101 А. thaliana, клонированный в клетках hsp104 мутанта S. cerevisiae, восстанавливал термотолерантность дрожжей, можно предполагать существование общих механизмов устойчивости к тепловому шоку у высших растений и дрожжей [7].
Кроме теплового шока, синтез БТШ могут индуцировать химические агенты, такие как ионы тяжелых металлов, этиловый спирт, аналоги аминокислот и т.д. [8]. Возможными индукторами синтеза БТШ могут быть и митохондриальные ингибиторы. Так известно, что воздействие азида натрия и динитрофенола приводило к индукции пуффов теплового шока в политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы [9].
Ранее нами было показано, что азид натрия значительно повышал термотолерантность S. cerevi-siae при росте на среде, содержащей глюкозу. Предполагалось, что протекторный эффект азида натрия может быть связан с индукцией синтеза БТШ 104 [10]. Для проверки этого предположения в настоящей работе мы сравнили действие азида натрия на базовую и индуцированную термотолерантность, используя родительский тип и hsp104 мутант S. cerevisiae, а также изучили изме-
нение синтеза БТШ104 при тепловом шоке в присутствии этого ингибитора.
МЕТОДИКА
В работе использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae двух штаммов: Т-74-Б694 (родительский тип) и мутант с делецией по гену HSP104 (получены от профессора Ьтёдшв! Б., Чикагский университет, США). Дрожжи поддерживали на твердой среде УБРБ (дрожжевой экстракт - 5 г/л, пептон - 10 г/л, глюкоза - 20 г/л и агар - 15 г/л) при 30°С.
Дрожжи выращивали в течение 14-16 ч при 30°С в колбах объемом 100 мл в 25 мл жидкой среды УБРБ или УБРва1 (глюкоза была заменена эквивалентным количеством галактозы) до достижения концентрации 107 клеток/мл.
Для изучения влияния предварительной обработки азидом натрия на изменение термотолерантности дрожжей в клеточную суспензию добавляли 0.15 мМ №N3 и инкубировали в течение 30 мин при 30°С. Для удаления ингибитора клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин в центрифуге РС-6 (Россия), несколько раз промывали и ресуспендировали в свежей среде УБРБ; 1 мл суспензии переносили в пробирки и экспонировали при 45 °С в течение указанных интервалов времени.
Для изучения действия ингибитора на развитие индуцированной термотолерантности суспензию дрожжей, выращенных при 30°С на среде УБРБ, инкубировали при 37°С в течение 30 мин в присутствии 0.15 мМ №N3. Затем клетки отмывали от ингибитора и подвергали действию теплового шока (45°С), как это описано выше. В отдельном эксперименте №N3 добавляли после предварительной тепловой обработки, непосредственно перед жестким тепловым воздействием. При изучении действия азида на базовую термотолерантность, №N3 добавляли к суспензии дрожжей, выращенных при 30°С на среде УБРБ или УБРва1, непосредственно перед тепловым шоком при 45°С. После окончания теплового воздействия суспензию клеток охлаждали, разводили и высевали на твердую среду УБРБ. Количество образовавшихся колоний учитывали после 2448 ч инкубации при 30°С. Выживаемость дрожжей определяли как процент образовавшихся колоний после теплового воздействия к количеству колоний до теплового шока.
Для изучения влияния №N3 на индукцию синтеза БТШ104 дрожжи родительского типа выращивали в 100 мл среды УБРБ или УБРва1 в колбах объемом 250 мл при 30°С до достижения требуемой концентрации, затем добавляли 0.15 мМ азида натрия и клетки инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем дрожжи осаждали центри-
фугированием (5000 об/мин, 5 мин), трижды промывали K-Na-фосфатным буфером (0.02 М KH2PO4, 0.04 М Na2HPO4, 0.15 M NaCl, рН 7.0), вновь осаждали (5000 об/мин, 5 мин) и хранили при -20°С в течение суток до выделения белка. Дрожжи размораживали, ресуспендировали в буфере для выделения белка (Трис-НС1-0.1 M, №-ДДС-0.003 М, Р-меркаптоэтанол - 0.001 М, рН 7.4-7.6), замораживали жидким азотом и растирали с кварцевым песком. Грубые клеточные компоненты удаляли центрифугированием (15 000 об/мин, 10 мин центрифуга К-24(ГДР)), белок осаждали 10%-ной ТХУ. Осадок белка трижды промывали ацетоном и растворяли в буфере для образца (Трис-HCl -0.625 М, Na-ДДС - 0.08 М, Р-меркаптоэтанол -0.1 М, глицерин 10%, бромфеноловый синий 0.001%, рН 6.8). Концентрацию белка определяли по методу Лоури [11]. После разделения белков путем Na-ДДС-электрофореза в 10%-ПААГ проводили иммуноблоттинг с антителами на БТШ104 [12].
Опыты повторяли не менее трех раз. Полученные результаты обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические величины и их отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Согласно результатам Sanchez и Lindquist [2], дикий тип и hsp104 мутант S. cerevisiae имели сходную базовую термотолерантность и только после предварительной тепловой обработки наблюдались значительные отличия в устойчивости к жесткому тепловому шоку. Однако как следует из рис. 1а, выживаемость клеток родительского штамма T-74-D694 (кривая 1), инкубируемых при 30°С и подвергнутых действию летального теплового шока при 45°С, значительно превышала выживаемость клеток hsp104 мутанта (кривая 3). Подобные результаты получены и другими исследователями, использующими производные от T-74-D694 штаммы S. cerevisiae [13]. Вероятно, такие различия в базовой термотолерантности объясняются относительно высоким уровнем конститутивного синтеза БТШ104 в штамме T-74-D694 (рис. 2а, трек 1).
Для изучения влияния предварительной обработки азидом натрия на термотолерантность дрожжи инкубировали в присутствии 0.15 мМ NaN3 в течение 30 мин при 30°С. Затем клетки отмывали от ингибитора и подвергали действию теплового шока при 45°С. При этом после 60 мин теплового шока наблюдалось трехкратное повышение выживаемости родительского типа (рис. 1а, кривые 1 и 2) и почти шестикратное - hsp104 мутанта (рис. 1а, кривые 3 и 4). Аналогичным образом NaN3 индуцировал термотолерантность Lac-tococcus lactis [14] и штамма W303-1B S. cerevisiae [15]. Таким образом, предобработка ингибитором индуцировала термотолерантность у обоих
100!
0
1009 10
0.1
0.01
(в)
30 60 90 Время, мин
(а)
4
120
2 1 4 3
120
(б)
Рис. 1. Действие азида натрия (0.15 мМ) на индуцированную термотолерантность родительского типа (1, 2) и hsp104 мутанта (3, 4) S. cerevisiae. Дрожжи, выращенные при 30°С на среде УБРЭ, инкубировали: а - при 30°С в течение 30 мин в отсутствии (1,3) или присутствии (2,4) №N3; б - при 37°С в течение 30 мин в отсутствии (1, 3) или присутствии (2, 4) №N3; в - при 37°С в течение 30 мин без №N3, который добавляли перед летальным тепловым шоком; контроль -кривые 1 и 3; №N3 -кривые 2 и 4. Клетки шокировали при 45°С в течение указанных интервалов времени.
изучаемых штаммов независимо от присутствия БТШ104.
Для изучения действия азида натрия на развитие индуцированной термотолерантности клетки,
Рис. 2. Действие 0.15 мМ азида натрия на синтез БТШ104 в клетках дрожжей S. cerevisiae. а - дрожжи родительского типа (1,3) и hsp104 мутанта (2, 4), выращенные на среде с глюкозой, инкубировали при 30°С (1, 2) или 37°С (3, 4); б - дрожжи родительского типа, выращенные на среде с глюкозой (1-4) или с галактозой (5-8), инкубировали при 30°С (1,2 и 5,6) или 37°С (2, 4 и 7,8) в присутствии (2, 4 и 6,8) или отсутствии №N3 (1, 3 и 5, 7). Белки разделяли в 10% ПААГ в присутствии ДДС-№,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.