НЕИРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 239-247
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577
ДЕЙСТВИЕ бактериального меланина
НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ В УСЛОВИЯХ ГЕНЕРАЦИИ ГАМК
© 2007 г. Д. С. Саркисян1' 2*, A. A. Галоян2, Р. Г. Камалян2, В. А. Чавушян1' 2, И. Б. Меликсетян1, М. В. Погосян1, О. В. Геворкян1, А. С. Овсепян3, 3. Э. Авакян1,
С. А. Казарян4, М. К. Манучарян2
1 Институт физиологии им. Л.А. Орбели НАН РА, Ереван, Республика Армения
2 Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА, Ереван, Республика Армения
3 НИИ биотехнологии, Ереван, Республика Армения 4 Институт тонкой органической химии им. АЛ. Мнджояна, НАН РА, Ереван, Республика Армения
Изменение частоты потока спайковой активности одиночных нейронов компактного отдела черной субстанции, вызванное на стимуляцию хвостатого ядра, изучали на крысах линии Альбино в условиях длительной регистрации при однократном и многократном, изолированном и комбинированном воздействии ГАМК, ГАМК-амида, глютамина и этаноламин-О-сульфата (ЭОС). Зарегистрировано торможение постстимульной активности под воздействием ГАМК. Тормозный эффект ГАМК-амида выявлен с несколько более длительным латентным периодом. Показан первоначальный возбудительный и последующий тормозный эффекты глютамина в комбинации с ЭОС. Последующее системное введение бактериального меланина, синтезируемого мутантным штаммом Bacillus thuringiensis (BT-M), вызывает четкую и длительную возбудительную реакцию во всех комбинациях воздействия ГАМК, ГАМК-амида, глютамина и ЭОС. Предварительное введение BT-M предотвращает тормозные эффекты ГАМК, ГАМК-амида и ЭОС, а также возбуждение в результате применения глютамина.
Ключевые слова: одиночная нейрональная активность, черная субстанция, хвостатое ядро, бактериальный меланин, глютамин, ГАМК, ГАМК-амид, этаноламин-О-сульфат.
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия, в связи с увеличением психических и нейродегенеративных заболеваний, вопросам взаимодействия нейротрансмит-теров в синхронизации работы нервных сетей в норме и патологии придается все большее значение. При ряде нейродегенеративных заболеваний констатированы нарушения коммуникативных связей различных нейротрансмиттерных систем, в частности между допамин, глютамат и ГАМК-ергической системами.
Показано, что нейромеланины (НМ) - природные антиоксиданты, эффект которых связан со значительным подавлением перекисного окисления липидов в мышцах (линолевой кислоты и ли-посомного фосфатидилхолина), выражающемся, в частности, в уменьшении содержания гидроперекисей линолевой кислоты [1]. Известно, что они наряду с липофусцином относятся к "возрастным" пигментам, постепенно накапливающимся с
* Адресат для корреспонденции: Республика Армения, Ереван 0028, ул. бр. Орбели, 22. Тел.: (374-91) 51-92-47; email: jsarkissyan@neuroscience.am
возрастом во всех клетках организма, в частности в кардиомиоцитах и нейронах в комплексе с липи-дами, лизосомальными ферментами и другими белками [2-4]. Несмотря на то, что при старении указанные пигменты откладываются в больших количествах, в частности в нижнем оливарном ядре человека, они малотоксичны и не приводят к нейрональной гибели [4].
Представляет интерес тот факт, что окислительный путь допаминового метаболизма в мозге человека ведет к формированию и аккумуляции НМ в цитоплазме большинства нигростриатных допаминергических нейронов [1, 5]. При болезни Паркинсона (БП) обнаружено значительное снижение (на 70%) числа меланизированных нейронов [5, 6], что, скорее всего, связано с дегенерацией нигростриатного тракта и резким падением концентрации предшественника НМ - дофамина. Известно, что подавляющая часть нейронов мозга производит аминокислотные медиаторы, ГАМК и глутамат, которые распределены по всему мозгу и участвуют во всех без исключения его функциях. Не удивительно, что в нарушениях нейрологических и психических функций мозга все чаще обозначается глутамат- и в особенности
ГАМК-ергический след. Это касается таких тяжелых патологий, как болезни Альцгеймера, Хантингтона и БП, шизофрения и эпилепсия, депрессивные и панические состояния, ишемии и инсульты [7-12]. Известно, что аналог глютами-на каинат используется для создания модели болезни Хантингтона путем повреждения ГАМК- и ацетилхолинсодержащих нейронов стриатума [13]. Показано и заметное уменьшение плотности NMDA-рецепторов данного участка мозга [14], a также гибель среднешипиковых ГАМК-ергиче-ских нейронов стриатума и глубинных слоев коры при этом заболевании [15].
Прослеживаемое при нервно-психических патологиях одновременное нарушение моноамино-вых, аминокислотных и других нейрорегулятор-ных механизмов является отражением их тесных взаимосвязей и в норме, что было предметом исследования настоящей работы, в которой изучено воздействие бактериального меланина до и после изолированного и комбинированного введения ГАМК, ГАМК-амида, глютамина и этаноламин-О-сульфата (ЭОС) на электрическую активность одиночных нейронов компактного отдела черной субстанции (S№) при стимуляции хвостатого ядра (NC). Изучение SN не в последнюю очередь обусловлено высоким содержанием в ней глютамат-и ГАМК-ергических, а также меланизированных нейронов. В то же время НМ в SN играет двойственную роль в качестве "черной дыры" в отношении широкого спектра токсических агентов (в том числе комплексных редоксактивных токсических металлов), одновременно выступая в роли системы, потенциально способной обеспечивать нейрональное повреждение [16].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на 17 зрелых разнополых крысах линии Альбино (200-300 г). В целом зарегистрировано 133 нейрона, в числе которых - 48 в норме и 75, подверженных длительному (от десятков до сотен мин) воздействию ГАМК (0.5-1 мг в 0.5 мл), ГАМК-амида (9 мг в 0.1 мл), ЭОС (0.5-1 мг в 1 мл), глютамина (0.5-1 мг в 1 мл), при его индивидуальном действии и в сочетании с ЭОС и раствора бактериального меланина (1-2 мл), синтезируемого мутантным штаммом Bacillus thuringiensis (BT-М), соответствующего разбавлению исходной концентрации (94 мг/мл) в
20 раз - ВТ-М/20, введенных внутрибрюшинно (в/б) и внутримышечно (в/м).
В остром эксперименте крысу обездвиживали 1%-ным дитилином (25 мг/кг, в/б), фиксировали в стереотаксическом аппарате и переводили на искусственное дыхание. Стереотаксически ориентированный стеклянный микроэлектрод с кончиком 1-2 мкм, заполненный 2М NaCl, вводили в SN для регистрации одиночной активности нейронов и интернейронов в ответ на одиночное и частотное (прямоугольными толчками тока длительностью 0.05 мс и частотой 50 и 100 Гц на протяжении 1 с) раздражение NC с ипсилатеральной (i) стороны. Отводящий и раздражающий электроды вводили согласно следующим стереотакси-ческим координатам по атласу Паксиноса и Вот-сона [17]: SNc (AP - 5, L ± 2, DV + 7.5-8.0 мм); Nucleus Caudatus Putamen (NC) (AP + 1.7, L ± 2-3, DV + 4-5). Активность проявлялась в качестве тетанической потенциации (ТП) или депрессии (ТД) с последующими посттетаническими проявлениями в виде посттетанической потенциации (ПТП) и/или депрессии (ПТД) различной латен-ции, выраженности и длительности, воспроизводимой в 10-30 испытаниях на одном и том же нейроне. К тому же учитывался эффект того или иного из использованных препаратов не только на одном нейроне, но и в отношении других - в данной популяции. Проводили предварительную регистрацию реактивности 3-5 интактных нейронов до и после фармакологического воздействия (с возвратом к тем же стереотаксическим координатам на примере как минимум от 2-х до 4-х из них) после многочасового изучения единичного нейрона с целью подтверждения однонаправленности реакции. Этим обеспечивалось длительное наблюдение за изменением проявления эффектов во времени при однократном и повторном введениях препаратов (при этом отмечено различие в эффектах в зависимости от исходного уровня активности).
Регистрацию проводили с помощью программы, обеспечивающей в режиме "on-line" селекцию спайков посредством амплитудной дискриминации. Строилась суммарная перистимульная гистограмма межспайковых интервалов (PeriEvent Time Histogram, РЕТН). Анализ полученных данных проводился по алгоритму, специально разработанному для оценки значимости отрезков
Рис. 1. Спайковая активность одиночного нейрона SNc, вызванная высокочастотной (100 Гц, 1 с) стимуляцией N0 в условиях исходного уровня (А, Б), предварительного введения глютамина (в/м 1 мг в 1 мл) (В) с последовательной инъекцией ВТ-М/20 (в/м 1 мл) (Е-И) на 60 мин действия глютамина и ГАМК (в/м 1 мг в 1 мл) к 60 мин действия ВТ-М (3-Л). Сильное повышение частоты ТП (В) до 60 мин (Г, Д) по сравнению с исходным уровнем (А, Б); отсутствие эффекта ГАМК на 5-60 мин его введения (3-Л) после 95 мин воздействия ВТ-М. Здесь и на следующих рисунках: ВТ-М - бактериальный меланин; спайк/с - частота импульсации; имп (%/исп.) - количество импульсов в процентах от общего числа испытаний в каждый последовательный промежуток времени (один бин равен 40 мс), справа от гистограмм указано число испытаний (исп.), слева - время воздействия указанного препарата в минутах.
спайк/сек д Б А
имп. (%/исп.)
70. 71.0
28
J
100 Гц 1 сек NCi
и-1-1-1-1-1-1-1-1-Г 1.5
10 50 сек
11 исп.
520
10 мин
глютамин208
|ц
50 бин Г
И-г
бин = 40 мс
В
-50 -25 0
1
г"и-1п п П. ппП
д
600
60 мин глютамин 240
9.3
Г^-1 -1--1--1-1-1-1-г
50 200 бин
Г
60 мин глютамин
10 исп.
------ — ----1.0
1 исп.
~1 I Г"
Ж 800
40 мин ГАМК 320
п-г
65 мин ВТ-М 5 мин ГАМК
140.6
Е
35 мин IВТ-М/20
-!---!-!-:-1-Г"1-1-1-
Д. ■ Л ■ ■ . лД.Ш ■ ^ Дд Н. ■ л ДЬ М. п . дД. ^прПмЗтии ^дД.
И
600
240
Иу
134.9
3
0.4
10 исп.
Т—:--Г"-1-1--1-1-1-
ГЪи—1.пПц,141^1 п ПиП1-11-1 Ли 1 .П, „„ „ „ ^ „_„ „ нППи11 ...-- 1-П „ |-П|1_„ п_йу,_.... р----!_ 10 исп
0.9
л
540
60 мин
ГАМК 216
92.2
К
55 мин ГАМК
-г"'-----1 -
1.0
^-п--П—___Ьпп— -Д-
Ч—"-,— 11 исп.
1
спайк/сек
А
имп. (%/исп.) 72 4
450 /2Л
-25 0 В
130
15 мин ГАМК 52
п-г
У
50
ДО
П-г
100 Гц 1 сек N0
50 сек
т-г
200 бин
9 исп.
бин = 40 мс
23
1-"Н-Г-1-1-Т"
10 исп.
Г
32
15 мин ВТ-М/20 46
"1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.