НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 4, с. 261-264
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.151.042
ДЕЙСТВИЕ ЭТАНОЛА И СИНТЕТИЧЕСКИХ ОКСИМОВ НА СОДЕРЖАНИЕ И ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ ГРУППЫ ГЛУТАМИНА
В МОЗГЕ И КРОВИ БЕЛЫХ КРЫС
© 2004 г. К. А. Гевондян1, Г. Г. Данагулян2, Д. X. Амбарцумян1, А. Г. Варданян1,
Р. Г. Камалян1*
1Институт биохимии им. Г. Бунятяна HAH РА, Ереван 2Институт органической химии HAH РА, Ереван
В работе исследовано влияние этанола и синтетических препаратов ряда оксимов, оказывающих ГАМК-подобное влияние на мозговое кровообращение, содержание аминокислот группы глутами-на в мозге и крови и активность ключевых ферментов их обмена. Показано, что этанол проявляет выраженное стимулирующее действие на активность глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы мозга, снижая содержание глутамина и глутамата в крови. Два из исследованных препаратов обращают действие этанола на содержание аминокислот в мозге, что, возможно, связано с усилением утилизации глутамина иммунными клетками.
Ключевые слова: глутамин, глутаминаза, глутаматдекарбоксилаза, оксимы, иммунные клетки.
Известно, что глутамин - основной источник нейромедиаторных аминокислот в мозге (глутамата и ГАМК), наиболее эффективно использующийся клетками иммуной системы. Кроме того, он участвует в синтезе нуклеиновых кислот и используется в качестве компонента сред культивирования тимоцитов, лимфоцитов, мононуклеаров периферической крови, способствуя их пролиферации [1-5]. Полагают, что мозг регулирует деятельность иммунной системы, получая в свою очередь сигналы от последней через нейрогормо-ны и иммуномедиаторы.
Поскольку концентрация глутамина в плазме крови высока и на поверхности иммунных клеток, в частности лимфоцитов, имеются рецепторы продуктов обмена глутамина, глутамата и ГАМК [6-8], представляло интерес изучить их содержание и активность ферментов их обмена в мозге и крови в норме и под воздействием ряда синтетических препаратов, имитирующих действие ГАМК на мозговое ковообращение [9, 10]. Немаловажной предпосылкой исследования явилось и то, что ГАМКергические препараты, как известно, обладают антистрессорной и противо-судорожной активностью [11-16], что используется в практической медицине и ветеринарии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пиримидинилкетоксимы 1, 2 и 3 были синтезированы Г.Г. Данагуляном и сотрудниками по ме-
*Адресат для корреспонденции: 375014 Ереван, ул. П. Севака, д. 5/1; тел: 27-68-34; e-mail: kamalyan37@mail.ru.
тодике, описанной ранее [17], а препарат 4 был приготовлен авторами настоящей работы. Исследованные препараты синтезированы в диметил-формамиде (ДМФА) с применением конденсации хлорпиримидинов (А-С) с эквимолярными количествами натриевых солей оксимов кетонов (схема). Выходы продуктов реакций высоки и составляют 75-90%.
Синтез 0-[2,4-диметилпиримидинил-2]-окси-мацетона [препарат 4]. К 1.25 г (0.055 моль) натриевой суспензии в 100 мл абсолютного эфира добавляли по каплям в течение 20 мин эфирный раствор 4 г (0.055 моль) оксима ацетона. После полного превращения натрия в аморфную соль оксима приливали 20 мл ДМФА. Из раствора отгоняли эфир и далее добавляли по каплям раствор 7.13 г (0.05 моль) 2,4-диметил-6-хлорпирими-дина (С) в 20 мл ДМФА, не допуская повышения температуры выше 35°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре 4-5 ч, далее в вакууме отгоняли ДМФА, а остаток экстрагировали хлороформом. Хлороформные вытяжки сушили сульфатом магния. Далее отгоняли хлороформ, остаток перегоняли. В результате получали 7.8 г (87%) соединения 4. Температура его кипения составляет 125°С при 2.5 мм рт. ст.; температура плавления - 50.5-51.5°С; Rf = 0.43 (в системе бензол-ацетон, 3 : 1); при хранении препарат кристаллизуется.
Элементный анализ: опытные данные (%): С -60.58; Н - 7.53; N - 23.69. С9Н13^0; расчетные данные (%): С - 60.31; Н - 7.30; N - 23.45.
X
У
N
А-С
Ме
+ №0—N=^
ъ Я
A. Х=С1; У=7=Ме.
B. Х=Ме; У=Ме; г=С1.
C. Х=Ме; У=г=С1.
Ме
Ме
рЬ
N-0 N
1
Ме
0—N
К
Я
N
Ме^4^ "ъ
1-4
2. 7=Ме; К=р-С1-С6И4.
3. г=С1; Я=РЬ.
4. 7=Ме; Я=Ме.
Схема синтеза пиримидинилкетоксимов (1-3) и 0-[2,4-диметилпиримидинил-2]оксимацетона (4).
Спектр ЯМРХИ (Уайаи-300 МГц, СДС13 5 м.д.) : 1.9 (3И, с, СИ3); 2.0 (3И, с, СИ3); 2.26 (3И, с, 2-СИ3); 2.42 (3И, с, 4-СИ3); 6.78(1И, с, 5-И).
Масс-спектр: 179 (5.9), 164 (18.3), 125 (0.5), 107(1.8), 96 (0.6), 56 (45.1).
Опыты проводили на крысах обоего пола весом 120 г, содержащихся на нормированном рационе в условиях вивария. Синтезированные препараты вводили животным в дозе 1 мг на животное за 3 ч до декапитации. Летальная доза составляла 5-6 мг на животное. В связи с плохой растворимостью в воде препараты растворяли в 40%-ном этаноле, так что вместе с препаратом животные получали примерно 1.5 г этилового спирта/кг веса животного. Кроме четырех опытных групп были использованы две контрольные; одной вводили 0.5 мл физраствора, другой - этанол (1.5 г/кг веса животного). Через 3 ч после введения препаратов животных декапитировали под легким эфирным наркозом, быстро извлекали на холоду исследуемые органы, готовили гомогенаты с использованием соответствующих буферных систем и определяли в них активности фосфат-активируемой глута-миназы (ФАГ) и глутаматдекарбоксилазы (ГД).
Активность ФАГ определяли в процессе инкубации гомогенатов тканей в 7г«-ИС1 буфере (рИ 8.6), содержащем 10 мМ глутамин и 15 мМ
двузамещенный фосфат натрия, в течение 30 мин при 37°С. Активность фермента выражали в нмо-лях глутамата, образующегося за 1 мин/мг белка.
Активность ГД определяли при инкубации гомогенатов тканей в среде, содержащей 0.1 М фосфат, 50 мМ глутамат и 5 мМ пиридоксальфосфат (рН 6.4). Инкубацию проводили по методу Лоу [18].
Содержание свободных аминокислот в экстрактах мозга и крови определяли нингидрино-вым методом после электрофоретического разделения в пиридин-ацетатном буфере (рН 4.0). Электрофорез проводили при напряжении 1200 В и силе тока 0.5 мА/см бумаги (^N-11) [19]. Во фракциях нейтральных аминокислот анализировали содержание амидного азота [20] и рассчитывали по нему концентрацию глутамина. Концентрацию белка определяли по методу Ьсшу [21].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что введение этанола (1.5 г/кг) вызывает значительное изменение активности ферментов, утилизирующих глутамин и глутамино-вую кислоту в мозге крыс. Так, активность ФАГ возрастает на 84% (13.46 и 24.76 нмоль/мин/мг
Таблица 1. Активность ФАГ и ГД в мозге крыс, нмоль/мин/мг белка
Фермент Контроль Этанол Этанол + вещество 1 Этанол + вещество 2 Этанол + вещество 3 Этанол + вещество 4
ФАГ ГД 13.5 ± 0.1 0.86 ± 0.20 24.8 ± 0.2* 1.85 ± 0.09* 21.1 ± 1.7 1.83 ± 0.11 18.4 ± 1.0** 1.44 ± 0.09** 20.7 ± 1.6** 1.61 ± 0.18 25.0 ± 0.5 1.62 ± 0.2
Примечание. Достоверность различий с контролем: * -р < 0.05 в сравнении с контролем; ** -р < 0.05 в сравнении с этанолом.
ДЕЙСТВИЕ ЭТАНОЛА И СИНТЕТИЧЕСКИХ ОКСИМОВ 263
Таблица 2. Содержание свободных аминокислот в мозге крыс, мкмоль/г
Аминокислота Контроль Этанол Этанол + + вещество 1 Этанол + + вещество 2 Этанол + + вещество 3 Этанол + + вещество 4
Глутаминовая кислота Глутамин ГАМК Аспарагиновая кислота 9.30 ± 0.25 5.28 ± 0.24 3.00 ± 0.12 5.20 ± 0.14 10.20 ± 0.50 8.20 ± 0.82* 2.68 ± 0.10 4.84 ± 0.20 7.85 ± 0.43 7.80 ± 0.80 2.80 ± 0.15 4.40 ± 0.40 9.30 ± 0.28 5.00 ± 0.06** 2.18 ± 0.15* 3.34 ± 0.12** 11.3 ± 0.38 6.50 ± 0.30 3.10 ± 0.08 3.13 ± 0.27** 6.54 ± 0.48** 3.60 ± 0.23** 1.19 ± 0.14* 2.00 ± 0.13**
Примечание. Обозн. см. табл. 1.
Таблица 3. Содержание глутамина и глутамата в крови крыс, мМ
Аминокислота Контроль Этанол Этанол + + вещество 1 Этанол + + вещество 2 Этанол + + вещество 3 Этанол + + вещество 4
Суммарная фракция нейтральных аминокислот Глутаминовая кислота Глутамин 2.00 ± 0.20 0.44 ± 0.18 0.75 ± 0.09 1.4 ± 0.04* 0.10 ± 0.01* 0.38 ± 0.03* 0.66 ± 0.01** 0.11 ± 0.008 0.22 ± 0.01** 1.57 ± 0.03 0.12 ± 0.01 0.34 ± 0.02 0.90 ± 0.04** 0.10 ± 0.06 0.20 ± 0.02** 0.68 ± 0.09** 0.09 ± 0.02 0.19 ± 0.01**
Примечание. Обозн. см. табл. 1.
белка), а активность ГД повышается более чем вдвое (0.86 и 1.85 нмоль/мин/мг белка). Синтезированные соединения на фоне этанола не оказывают существенного влияния на активность исследуемых ферментов, за исключением вещества 2, которое несколько ослабляет эффекты этанола. Оно снижает степень активации этанолом ФАГ (24.76 и 18.40 нмоль/мин/мг белка) с 84 до 36%, а ГД - с 115 до 67%. Тенденция ослабления эффектов этанола отмечается и при введении вещества 3, но она менее выражена. При определении концентрации эндогенных аминокислот семейства глутамина в тканях мозга крыс была выявлена следующая картина (табл. 2): содержание глутаминовой кислоты в коре мозга крыс, получавших этанол и вещество 3 в этаноле, проявляет тендецию к увеличению, которое достоверно в последнем случае. Напротив, вещества 1 и 4 снижают уровень глутамата в сравнении с контрольной группой животных и группой, получавшей этанол.
Так, вещество 1 снижает содержание глутамата в коре мозга по сравнению с контрольной и этаноловой группами на 15.6 и 23.1% соответственно, а вещество 4 на 29.7 и 36%. На фоне активации ФАГ этанолом неожиданным представляется повышение уровня глутамина. Так, содержание глутамина, которое, казалось бы, должно было убывать при почти двукратной активации ФАГ этанолом, возрастает на 55%. Исследуемые препараты снимают (вещество 2), ослабляют (вещества 1 и 3) и обращают (вещество 4) эффект этанола. К сожалению, нами не определялась активность глутаминсинтетазы, которая в мозге значительно выше таковой ФАГ, и ее незначительная активация могла бы нивелировать последствия актива-
ции ФАГ. Из всех исследуемых препаратов вещество 4 наиболее эффективно подавляло действие этанола на уровень глутамина, снижая его на 56%.
Это же вещество наиболее эффективно снижает уровень таких метаболитов, как ГАМК и ас-партат. Так, уровень ГАМК, который падал под действием этанола всего на 11%, при введении последнего с веществом 4 снижался по сравнению с контролем на 61.3%. Достоверное снижение уровня ГАМК наблюдалось и при введении вещества 2 (на 27.4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.