ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 127-130
УДК 581.1
ДЕЙСТВИЕ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ Fucus evanescens НА ФОРМИРОВАНИЕ ВТМ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ В КЛЕТКАХ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА
© 2007 г. Л. А. Лапшина, А. В. Реунов, В. П. Нагорская, Т. Н. Звягинцева, Н. М. Шевченко
Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток Поступила в редакцию 11.05.2006 г.
Исследовали действие фукоидана (1.3;1.4-а^-фукана) - сульфатированного полисахарида, обнаруженного в бурой водоросли Fucus evanescens, на формирование в инфицированных вирусом табачной мозаики (ВТМ) клетках листьев табака (Nicotiana tabacum L.) ВТМ-специфических гранулярных и трубчатых включений, состоящих, по существующим представлениям, из вирус-кодируемых белков - компонентов вирусной репликазы. Через 4 суток после заражения листьев ВТМ (1 мг/мл) характерным признаком развития инфекции в присутствии фукоидана (1 мг/мл) было преимущественное образование в клетках гранулярных включений, наличие которых связывается с ранними стадиями репродукции вируса. В содержащих вирус клетках необработанных фукоиданом инфицированных листьев обнаруживались, главным образом, трубчатые включения, образующиеся предположительно из гранулярных на поздних стадиях инфекционного процесса. Эти наблюдения показывают, что фукоидан вызывает задержку развития ВТМ-индуцированной инфекции.
Fucus evanescens - Nicotiana tabacum - вирус табачной мозаики - устойчивость к болезням - фуко-идан
ВВЕДЕНИЕ
При разработке мер борьбы с фитопатоген-ными вирусами значительное внимание исследователей привлекает применение экологически безопасных соединений, обладающих способностью стимулировать устойчивость растений [1-3]. К таким соединениям относятся различные полисахариды: 1.3;1.6^^-глюканы из грибов [4-7] и бурых водорослей [8, 9]; 1.3;1.4^-й-глюкан из лишайника Cetraria islandica [10, 11]; хитозан [12, 13]; олигосахариды, полученные из ксилоглюкана [14] и галактоглюкоманнана [15]; K/ß-каррагинан из красной водоросли Tichocarpus crinitus [16].
В исследованиях ряда авторов показано [17, 18], что антивирусной активностью в отношении некоторых вирусов животных и человека обладают фукоиданы - сульфатированные полисахариды, выделенные из бурых водорослей. О влиянии таких полисахаридов на развитие вирусных инфекций у высших растений до недавнего времени
Сокращение: ВТМ - вирус табачной мозаики. Адрес для корреспонденции: Лапшина Лариса Анатольевна. 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159. Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН. Факс: 007 (4232) 314-050; электронная почта: piboc@stl.ru
не сообщалось. Мы впервые показали [19], что фукоидан из бурой водоросли Fucus evanescens ингибирует накопление вируса табачной мозаики (ВТМ) в листьях табака. В данном сообщении представлены результаты электронно-микроскопического изучения действия фукоидана на формирование в клетках листьев табака ВТМ-специ-фических включений, участвующих в репликации вируса [20].
МЕТОДИКА
В работе использовали 4-недельные растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун, выращенные в теплице. Для исследований были отобраны 4 растения с одинаковыми морфологическими параметрами (высотой, листорасположением, количеством ярусов, размерами листьев в соответствующих ярусах). Препарат фукоидана, выделенный из бурой водоросли Fucus evanescens в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, представлял собой 1.3;1.4-а^-фукан, суль-фатированный, в основном, по С2-положению остатков фукозы [21]. Заражение листьев осуществляли обыкновенным штаммом ВТМ, полученным по методике Otsuki с соавт. [22].
От каждого из предназначенных для работы растения отделяли по одному молодому листу
ЦВ
ЦВ
ЦВ
ВЧ
(в)
! 1 мкм ,
Рис. 1. Участки паренхимных клеток листьев табака через 4 суток после заражения ВТМ. а - фрагмент клетки с вирусными частицами (ВЧ), б -видны гранулярные включения (ГВ), в - видны трубчатые включения (ТВ). Я - ядро, Хл - хлоропласт, ЦВ - центральная вакуоль.
длиной 5 см. Сорванные листья разрезали вдоль средней жилки и напыляли на них карборунд. Половинки двух листьев инокулировали смесью ВТМ и фукоидана (опыт), либо только вирусом (контроль), а половинки двух других листьев за 24 ч до заражения смачивали фукоиданом (опыт), либо водой (контроль). Во всех экспериментах концентрации ВТМ и фукоидана составляли 1 мг/мл. Обработанные листья промывали проточной водой и помещали во влажную камеру.
Через 4 суток после заражения половинок листьев из средней части каждой из них вырезали по 5 небольших кусочков ткани и фиксировали их 3 ч в 6.5%-ном растворе глутарового альдегида в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4). Затем образцы дополнительно фиксировали 2 ч в 1%-ном раство-
Рис. 2. Участок паренхимной клетки листа табака через 4 суток после инокуляции смесью ВТМ и фукои-дана.
Обозначения те же, что на рис. 1.
ре четырехокнсн осмня ("Реахим", Россия), обезвоживали в спирте и ацетоне и заключали в арал-дит ("Fluka AG", Швейцария). Срезы, полученные от 20 опытных и 20 контрольных блоков на ультратоме LKB-III ("LKB", Швеция), помещали на покрытые формваровой пленкой-подложкой сеточки, окрашивали водным раствором уранил-ацетата и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе JEM 7A ("Jeol", Япония). При оценке влияния фукоидана на образование ВТМ-специфических включений в клетках определяли объемную плотность включений, используя ранее описанный метод [23]. В расчетах использовали данные, полученные для срезов 100 клеток, произвольно выбранных на 10 сеточках (на каждой сеточке анализировали по 10 клеток). Результаты обрабатывали статистически, используя t-критерий Стьюдента при доверительной вероятности P = 0.95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При электронно-микроскопическом исследовании ультратонких срезов клеток листьев табака, инокулированных ВТМ, обнаружено, что через 4 суток после заражения листьев многие клетки содержат значительное количество вирусных частиц, образующих различные скопления в цитоплазме (рис. 1 а-в). Наряду с вирусными скоплениями в зараженных клетках наблюдали описанные ранее [24] ВТМ-специфические гранулярные (рис. 16) и трубчатые (рис. 1в) включения. Проведенный морфометрический анализ показал, что трубчатые включения занимают в зараженных клетках значительно больший относительный объем, чем гранулярные (таблица).
Через 4 суток после инокуляции листьев смесью ВТМ и фукоидана в клетках обычно наблюдали небольшие вирусные агрегаты (рис. 2).
ДЕЙСТВИЕ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ 129
Влияние фукоидана на объемную плотность ВТМ-специфических включений, формируемых в паренхимных клетках листьев табака через 4 суток после заражения ВТМ
Инокуляция листьев Объемная плотность, % от объема клетки
гранулярные включения трубчатые включения
ВТМ 0.25 ± 0.03 1.20 ± 0.15
ВТМ + фукоидан одновременно 0.32 ± 0.04 0.06 ± 0.01
ВТМ через 24 ч после обработки фукоиданом 0.89 ± 0.09 0.23 ± 0.03
Примечание. n = 100.
ВТМ-специфические включения были представлены, главным образом, гранулярными образованиями (рис. 2), тогда как трубчатые включения обнаруживали редко. При обработке листьев фу-коиданом за 24 ч до заражения и последующей инокуляции их ВТМ клетки содержали заметно меньше вируса, чем в контроле, но больше, чем при инокуляции листьев смесью ВТМ и фукоидана. В этом случае гранулярные включения наблюдали в клетках значительно чаще, чем трубчатые. Результаты морфометрического анализа влияния фукоидана на образование в клетках ВТМ-специфических включений представлены в таблице.
Известно [24], что ВТМ-индуцированные гранулярные включения формируются в клетках на ранних стадиях репродукции вируса. Затем по мере развития инфекции они трансформируются в трубчатые комплексы, которые в конце концов распадаются на отдельные трубки. С помощью меченных коллоидным золотом антител показано, что и гранулярные [20], и трубчатые [25] включения состоят из ВТМ-кодируемых белков -компонентов вирусной РНК-репликазы. Высказано предположение [20], что гранулярные включения являются местом репликации вирусных РНК. Обнаружение в таких включениях частиц ВТМ [26] может свидетельствовать о том, что в них осуществляется и сборка вирионов.
Представляется вероятным, что после завершения внутриклеточного синтеза РНК ВТМ молекулы вирусной РНК-репликазы, локализованные и активно функционирующие в гранулярных включениях, на поздних стадиях инфекции кристаллизуются, формируя неактивные трубчатые образования. Как известно [27], кристаллизация белков (в том числе и ферментативных) с образованием трубчатых структур широко распространена в клетках растений при утрате этими белками метаболической активности.
Наличие в инфицированных ВТМ клетках гранулярных включений, по-видимому, свидетельствует о протекании ранних стадий биосинтеза вируса, а формирование трубчатых включений -о его завершении. Появление в клетках инфицированных ВТМ листьев табака, обработанных
фукоиданом, преимущественно гранулярных включений, а в необработанных полисахаридом -трубчатых свидетельствует о том, что в первом случае развитие инфекции тормозится и "задерживается" уже на ранних стадиях. Это согласуется с меньшим накоплением ВТМ в клетках обработанных фукоиданом листьев. Особенно четко это проявлялось при инокуляции листьев смесью вируса и полисахарида. Причина торможения развития инфекции фукоиданом, на наш взгляд, может быть связана с его возможным ингибирую-щим действием как на проникновение вируса в клетки, так и на внутриклеточную репродукцию вируса, приводящие к изменениям в метаболизме ВТМ-инфицированных клеток.
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48540-а и программой фундаментальных исследований Президиума Российской академии наук "Молекулярная и клеточная биология".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лахматова ИТ. Индукция устойчивости растений к вирусам биологически активными веществами (иммунизация) // С.-х. биология. 1992. № 3. С. 1322.
2. Lyon G.D, Reglinski T, Newton A.C. Novel Disease Control Compounds: The Potential to "Immunize" Plants
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.