ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 432, № 6, с. 838-841
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.3
ДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА НА УПАКОВКУ МОЛЕКУЛ ДНК
В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ
© 2010 г. С. Г. Скуридин, В. А. Дубинская, В. М. Рудой, О. В. Дементьева, С. Т. Захидов, Т. Л. Маршак, В. А. Кузьмин, В. И. Попенко, Ю. М. Евдокимов
Представлено академиком А.А. Макаровым 11.02.2010 г. Поступило 11.02.2010 г.
Ответ на вопрос о токсическом действии нано-частиц определяет возможность их применения в различных областях техники, биотехнологии и медицины. Объектом, привлекающим внимание ученых разных специальностей, включая специалистов в области медицины, являются наноча-стицы золота (Аи), что обусловлено набором их специфических физико-химических свойств. Однако однозначный ответ на вопрос о токсичности этих частиц в настоящее время не получен, что связано, по-видимому, с отсутствием стандартизованной тест-системы, позволяющей сопоставлять результаты разных авторов. В настоящей работе впервые использованы частицы холестери-ческой жидкокристаллической дисперсии ДНК, моделирующей некоторые свойства плотно упакованных молекул ДНК в живых системах, в качестве простой, легко воспроизводимой тест-системы, меняющей свои аномальные оптические свойства в ответ на действие наночастиц Аи. Сопоставление действия наночастиц Аи выявило существование "размерного" эффекта — чем меньше диаметр наночастиц Аи, тем сильнее они нарушают упорядоченную упаковку молекул ДНК.
Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта
Российской Академии наук, Москва
Научно-исследовательский и учебно-методический
центр биомедицинских технологий ВИЛАР РАСХН,
Москва
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской Академии наук, Москва Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской Академии наук, Москва
Известно, что химические и физические свойства наночастиц заметно отличаются от свойств, характерных для "массивного" образца того же самого материала. Один из наиболее ярких примеров, иллюстрирующий существование таких различий — наноразмерные частицы золота, используемые как в научных, так и прикладных целях [1—3], в частности, для диагностики и терапии некоторых заболеваний [4—6]. В этой связи представляет интерес вопрос о том, какова токсичность наночастиц Au, и как они могут влиять на клеточные структуры [7—9].
В литературе имеется несколько работ, в которых предпринимались попытки исследовать токсичность наночастиц Au в зависимости от их размера, формы и природы модифицирующих групп на поверхности [7—10]. Наночастицы Au (2 нм), содержащие на поверхности катионные группы, в целом более токсичны при значительно более низкой концентрации, чем наночастицы Au, модифицированные анионными группами. Наночастицы Au (кластеры Au55) обладают такой же ци-тотоксичностью по отношению к клеткам опухоли легкого, как и производные цис-платины [10]. Оказалось также, что цитотоксичность наноча-стиц Au зависит от типа клеток [1]. Тем не менее данные, приведенные в работах [1, 11], показывают, что в целом информация о биологических эффектах, вызываемых наночастицами Au, достаточно противоречива.
В качестве простой, легко воспроизводимой модели для оценки in vitro действия наночастиц Au на свойства генетически значимых объектов нами были использованы частицы холестериче-ской жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК, поскольку свойства ХЖКД ДНК могут меняться как при нарушении вторичной структуры молекул ДНК, так и при возмущении структуры квазинематических слоев в частицах этой дисперсии.
АЛ 0
-5 ■ 102 -10 ■ 102 -15 ■ 102 -20 ■ 102
АЛ
240
260
280 300 X, нм
320
340
Рис. 1. Спектры КД ХЖКД ДНК, предварительно сформированной в водно-солевом растворе ПЭГ (1), а затем обработанной наночастицами Аи, диаметр которых составлял 15, 5, 2 нм (2—4 соответственно). 1 - КОТТрОТЬ Снано-Аи = 0; 2 - Снано-Аи-15 нм = 122 Х
X 1011 частиц/мл; 3 - СНано-ли-5 нм = 7.77 ' 10
стиЦ/мл; 4 - Снано-Аи-2 нм
12
ча-
= 2.22 • 1014 частиц/мл.
-5 ■ 102
-10 ■ 10
-15 ■ 10
В экспериментах использовали синтезированные коллоидно-химическими методами [3] сферические наночастицы Au, средний диаметр которых составлял ~2.5 и 15 нм.
Использовали препарат ДНК с молекулярной массой (~0.3-0.7) • 106 Да ("Sigma", США), а также препарат полиэтиленгликоля (ПЭГ) (мол. масса ПЭГ 4000 Да, "Serva", Германия). Растворы ДНК и ПЭГ готовили на 0.3 М NaCl, содержащем 10-2 М №+-фосфатный буфер (pH ~ 7.0). Концентрация ДНК и ПЭГ в экспериментальных растворах составляла соответственно 8.89 и 151.11 мг/мл.
Спектры КД представляли в виде зависимости разности лево- и правополяризованного света (АЛ) от длины волны (X). (АЛ = (AL - PR) • 10-6 оптич. единиц). Во всех случаях использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Перед регистрацией спектра КД кювету с образцом выдерживали в течение 30 мин при 60°C.
Обработка ХЖКД ДНК наночастицами Au (диаметром ~2 нм) приводит к уменьшению ее аномальной оптической активности даже при комнатной температуре. Повышение температуры раствора до 45-60°С сопровождается усилением этого эффекта (рис. 1). Если средний диаметр наночастиц Au составляет 2 нм, то амплитуда аномальной полосы в спектре КД уменьшается на 75%, а при использовании наночастиц Au диаметром 15 нм - только на 20%.
Цианиновый краситель - "SYBR Green", как известно [11], интеркалирует между парами осно-
\ и
Я \
\1 1
1, 2 , i i i i
240
320
400 480
X, нм
560
640
Рис. 2. Спектр КД ХЖКД ДНК, сформированной в водно-солевом растворе ПЭГ (1) и спектры КД этой же дисперсии, последовательно обработанной циа-ниновым красителем "SYBR Green" и наночастицами Au (2 и 3 соответственно). 1 — контроль,
^SYBR Green = 0, ^нано-Аи-2 нм = 0; 2 - CSYBR Green =
= 9.795 ■ 10-6 М, С = 9.795 • стиц/мл.
нано-Au^ нм
= 0; 3 - С
SYBR Green :
10-6 М, с
нано-Au^ нм
= 2.22 ■ 10
14
ча-
ваний молекул ДНК в составе частиц ХЖКД; это приводит к появлению дополнительной полосы в спектре КД в области поглощения красителя в видимой области спектра (рис. 2, кривая 2). Краситель, интеркалировавший между парами оснований ДНК в составе частиц ХЖКД, сохраняет интенсивную флуоресценцию. Однако при действии наночастиц Au на частицы ХЖКД-ком-плекса ДНК-''SYBR Green" флуоресценция красителя резко уменьшается, что также свидетельствует о действии наночастиц Au на ХЖКД ДНК (рис. 2, кривая 3).
Наконец, о действии наночастиц Au на ХЖКД ДНК свидетельствуют и данные конфокальной микроскопии. В основу объяснения наблюдаемых при помощи разных методов оптических эффектов могут быть положены две причины.
Во-первых, известно, что наночастицы Au диаметром 2 нм могут размещаться в широкой бороздке В-формы молекулы ДНК [12]. Если наночастицы Au малого диаметра (2 нм) могут фиксироваться в широких бороздках соседних молекул ДНК [13], то при определенной концентрации таких частиц в составе молекул ДНК, а, следовательно, и в квазинематическом слое характер взаимодействия между соседними молекулами ДНК в частице ХЖКД изменится. Возмущение структуры квазинематического слоя приведет к нару-
0
840
СКУРИДИН и др.
Рис. 3. Деконденсированные ядра сперматозоидов мышей, окрашенные толуидиновым синим: а — контроль, б — опыт.
шению всей пространственной структуры частиц ХЖКД ДНК (спиральная закрутка соседних слоев может уменьшиться), что приведет к уменьшению их аномальной оптической активности. При размере наночастиц Au в 15 нм оптический эффект практически отсутствует просто в силу того, что при комнатной температуре проникновение наночастиц такого размера в квазинематический слой затруднено и, кроме того, по стерическим причинам они не могут фиксироваться в широкой бороздке молекул ДНК. Таким образом, структура квазинематического слоя может эффективно "отзываться" на возмущение, вносимое наночастицами Au определенного размера.
Во-вторых, может проявляться и еще один эффект, отражающий связывание наночастиц Au с молекулами ДНК. Наночастицы Au, взаимодействуя с отрицательно заряженными атомами кислорода фосфатных групп и парами азотистых оснований ДНК, могут вызывать возмущение электронной структуры и конформационной однородности азотистых оснований (хромофоров) вдоль цепи молекулы ДНК, что приведет к нарушению вторичной структуры В-формы ДНК [12, 14]. В этих условиях как амплитуда аномальной полосы в спектре КД ХЖКД ДНК, так и флуоресценция красителя SYBR Green могут уменьшаться. Эффект носит "размерный" характер и прямо зависит от степени связывания наночастиц Au с молекулами ДНК. Таким образом, однородность вторичной структуры молекул ДНК может нарушаться под действием наночастиц Au только определенного размера, что может сопровождаться изменением оптических свойств частиц ХЖКД ДНК.
Полученные данные показывают, что наноча-стицы Au малого размера легко взаимодействуют с молекулами ДНК, т.е. действие наночастиц Au с большой вероятностью можно уподобить генетическим эффектам молекул, обладающих мутагенными свойствами. Это позволяет предположить, что в случае действия наночастиц Au на биологические объекты (вирусы, хромосомы простейших, спермии), для которых характерна пространственная упаковка фрагментов молекулы ДНК, аналогичная ее упаковке в частицах жидкокристаллической дисперсии, также будет наблюдаться эффект нарушения пространственной упаковки ДНК, который может сопровождаться генетическими последствиями. Действительно, опыты с использованием модельной системы, имитирующей образование мужского пронукле-уса и сигнализирующей о возможных потенциальных повреждениях в структуре гаметического ДНП-комплекса или о дефектах генома, показали, что наночастицы Au нарушают процесс деконден-сации ядерного хроматина в сперматозоидах мышей. Морфологически, по степени разбухания ядер, распаковки хроматина гаметы, инкубировавшиеся в среде с наночастицами Au, существенно отличаются от контроля (рис. 3). При равных условиях эксперимента число сперматозоидов, достигши
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.