ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 435, № 5, с. 699- 702
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.3:57.082+577.112.6
ДЕЙСТВИЕ ПРОПРАНОЛОЛА НА LPS-ИНДУЦИРОВАННУЮ
АКТИВАЦИЮ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА © 2010 г. М. М. Юринская, М. Г. Винокуров, Е. Б. Гражданкин, С. В. Грачёв
Представлено академиком И.И. Дедовым 19.05.2010 г. Поступило 21.05.2010 г.
Миелоидные клетки, участвующие в регуляции врожденного иммунитета, играют важную роль в механизме развития сепсиса и эндотоксинового шока, вызванного грамотрицательными бактериями. Активатором патологических процессов в организме человека при грамотрицательном сепсисе являются компоненты клеточной стенки грамот-рицательных бактерий — липополисахариды (LPS, эндотоксины) [1]. В распознавании LPS участвуют специфические Toll like-рецепторы (T1R4) клеток-мишеней, которые совместно с CD14, MD2, CD11/CD18 и другими рецепторами и белками образуют рецепторный комплекс, необходимый для передачи активационного сигнала от рецепторов к факторам транскрипции клеток-мишеней [2].
В патогенезе воспалительных заболеваний (в том числе и сепсиса) ключевая роль принадлежит нейтрофилам. LPS вызывают праймирование и активацию нейтрофилов (увеличивают продукцию активных форм кислорода (АФК) [3], экспрессию р2-интегринов [4]), увеличивают продолжительность жизни циркулирующих в кровяном русле этих клеток, ингибируя их апоптоз [5].
Наряду с рецепторами эндотоксинов миелоидные клетки: макрофаги, моноциты, а также и ней-трофилы экспрессируют адренорецепторы [6].
Ранее было показано, что пропранолол—р-ад-реноблокатор, действующий как на рг, так и на р2-адренорецепторы (блокатор неизбирательного действия), — снижает адреналин-индуцирован-ное ингибирование активации миелоидных клеток при действии LPS [7], влияет на функционирование клеток врожденного иммунитета при сепсисе [8] и увеличивает активность НАДФН ок-сидазы в присутствии формил-метионин-лей-цин-фенилаланина (fMLP) [9].
Институт биофизики клетки
Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва
Больница Пущинского научного центра Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Целью настоящей работы было исследование действия пропранолола на механизмы LPS-инду-цированной активации нейтрофилов при стимуляции этих клеток fMLP.
В работе использовали следующие вещества: среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка, LPS E. coli (LPSE.coli), серотип O55:B5, SB203580 (ингибитор p38 митогенактивируемых протеинкиназ), PD98059 (ингибитор экстраклеточных регуляторных киназ), Wortmannin (ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы), пропранолол, иодид пропидия, HEPES-буфер, антибиотики, дигитонин, фиколл 400, фосфатный буфер (PBS), раствор Хенкса фирмы "Sigma" (США), анти-CD11b/CD18, меченные флуоресцеинизо-тиоцианатом (FITC), (анти-CD11b/CD18-FITC) фирмы "Caltag" (США).
Нейтрофилы выделяли из крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слойном градиенте фи-колла—верографина (1.119 и 1.077 г/мл). Чистоту выделенных нейтрофилов контролировали по их морфологии. Содержание нейтрофилов в образце составляло ~98% от общего количества клеток.
Жизнеспособность выделенных нейтрофилов во всех экспериментах контролировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием флуоресцентного зонда иодида пропидия (30 мкМ) путем измерения доли клеток, непроницаемых для иодида пропидия, от общего количества клеток (в присутствии 40 мкг/мл дигито-нина). Жизнеспособность выделенных клеток составляла 98-99%.
Генерацию активных форм кислорода нейтро-филами определяли хемилюминесцентным методом [10]. Нейтрофилы в концентрации 0.2 • 106/мл в растворе Хенкса в присутствии 2% аутологиче-ской сыворотки и люминола (3.5 • 10-4 М) помещали в эппендорфах в термостатируемый люми-нометр 1250 LKB (Швеция). В качестве активатора генерации АФК нейтрофилами использовали fMLP (1 • 10-6 М), перед добавлением которого нейтрофилы инкубировали 25 мин при 37°C. При исследовании действия ингибиторов на эндоток-
700
ЮРИНСКАЯ и др.
Хемилюминесценция, %
400 г
350 300 250 200 150 100 50
Флуоресценция, отн. ед.
500 г .
50 100 150 200
Концентрация пропранолола, мкМ
Рис. 1. Действие пропранолола на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами в присутствии 20 нг/мл LPS (1) и в отсутствие LPS (2).
450
400
350
300
250
■Ш 1
1=1 2
I
LiL
J,
0 20 50 200
Концентрация пропранолола, мкМ
Рис. 2. Связывание FITC-конъюгированных моно-клональных антител к CD11b с нейтрофилами (106 клеток/мл). 1 — в отсутствие LPS, 2 — в присутствии LPS. Концентрация LPS 100 нг/мл.
0
синзависимое образование АФК нейтрофилами клетки вначале инкубировали 20 мин с ингибиторами при комнатной температуре.
Для определения уровня экспрессии клеточных рецепторов CD11b/CD18 на поверхности нейтрофилов применяли метод проточной цито-метрии с использованием соответствующих мо-ноклональных антител (анти-CDHb), конъюги-рованных с FITC.
Полученные данные анализировали с помощью программы SigmaPlot.
В первой серии экспериментов мы проанализировали действие пропранолола (20—200 мкМ) на продукцию активных форм кислорода, генерируемых нейтрофилами в ответ на стимуляцию fMLP (рис. 1). LPS (20 нг/мл) вызывал увеличение продукции АФК нейтрофилами на 250%. В присутствии (рис. 1, 1) и в отсутствие LPS (рис. 1, 2) при действии пропранолола (20—100 мкМ) наблюдалось дозозависимое увеличение продукции АФК нейтрофилами, которое достигало максимума при концентрации пропранолола в интервале от 100 до 200 мкМ. В этом диапазоне концентраций пропранолола разница между хемилюминесцен-цией (ХЛ) активированных и не активированных эндотоксином нейтрофилов составляла не более 50% от уровня ХЛ контрольных нейтрофилов (рис. 1).
Во второй серии экспериментов исследовано действие пропранолола на экспрессию CD11b/CD18-рецепторов нейтрофилов при действии эндотоксинов. В диапазоне концентраций 20—200 мкМ про-пранолол увеличивал экспрессию CD11b/CD18-рецепторов нейтрофилов как без (рис. 2, 1), так и в присутствии LPS (рис. 2, 2).
В третьей серии экспериментов исследовано действие пропранолола (в присутствии или в отсутствие LPS) на продукцию АФК нейтрофилами в присутствии ингибиторов ферментов (p38MAPK, ERK, PI-3K), участвующих в передаче регулятор-ного сигнала от рецептора эндотоксинов к факторам транскрипции (рис. 3). Рабочие концентрации указанных ингибиторов были выбраны исходя из результатов наших исследований [11] и работ [12, 13].
Ингибитор p38MAPK (SB203580) вызывал значительное ингибирование образования АФК нейтрофилами как без пропранолола (рис. 3а, К), так и в его присутствии (рис. 3а, Про). При этом происходило ингибирование LPS-индуцированной генерации АФК нейтрофилами в присутствии и без пропранолола до значений хемилю-минесценции, близкой к ХЛ контрольных клеток (рис. 3а, К, 1). Ингибитор экстраклеточных киназ (PD98059) незначительно ингибировал ХЛ неактивированных и активированных липополисаха-ридом контрольных (без пропранолола) нейтрофилов (рис. 3б, К, 1, 2). В присутствии пропранолола PD98059 также незначительно ингибировал продукцию АФК нейтрофилами как в присутствии, так и без LPS (рис. 3б, Про, 1, 2). Ингибитор Wortmannin снижал ХЛ контрольных и активированных LPS-нейтрофилов примерно одинаковым образом (рис. 3в, К).
Пропранолол (20—200 мкМ) вызывал увеличение продукции АФК нейтрофилами при стимуляции fMLP на 300% (рис. 1), что хорошо коррелирует с [9]. LPS без пропранолола увеличивал активацию продукции АФК нейтрофилами на 250%. При совместном действии пропранолола и липопо-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 435 № 5 2010
ДЕЙСТВИЕ ПРОПРЛНОЛОЛЛ
701
Рис. 3. Влияние ингибиторов на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами при действии пропранолола и LPS. K — без пропранолола, Про — 50 мкМ пропранолола. 1 — без LPS, 2 — 20 нг/мл LPS. а — 2 мкМ SB203580, б — 10 мкМ PD98059, в - 20 нМ Wortmannin.
лисахарида активация продукции АФК этими клетками составляла 360%, что может указывать на взаимосвязь сигнальных путей пропранолола и LPS в нейтрофилах. Известно, что при активации нейтро-филов эндотоксинами происходит увеличение экспрессии р2-интегриновых CD11b/CD18-рецепто-ров [4]. Пропранолол увеличивал экспрессию этих рецепторов как в присутствии LSP, так и при его отсутствии (что коррелирует с данными [14]), причем при совместном действии пропранолола и LPS экспрессия CD11b/CD18-рецепторов незначительно превышала экспрессию этих рецепторов при действии только пропранолола (рис. 2), что согласуется с данными рис. 1.
Для изучения возможного влияния пропраноло-ла на пути внутриклеточной трансдукции сигналов от рецепторов эндотоксинов было исследовано действие специфических ингибиторов сигнальных путей на продукцию АФК нейтрофилами в присутствии и в отсутствие пропранолола. Ингибиторный анализ показал, что ингибитор p38MAPK (SB203580) значительно снижал активацию нейтро-филов под действием LPS и под действием пропра-нолола, что указывает на участие p38MAPK в механизме активации продукции АФК нейтрофилами под действием этого антагониста р2-адреноре-цепторов. PD98059 незначительно ингибировал продукцию АФК контрольных и активированных LPS-нейтрофилов, что коррелирует с данными [12]. В присутствии пропранолола ингибирова-ние продукции АФК также было незначительно, что указывает на незначительный вклад экстра-
клеточных киназ в механизм активации нейтро-филов при действии пропранолола. При действии Wortmannin происходило значительное инги-бирование продукции AФK во всех экспериментальных пробах, это указывает на участие PI-3K в механизме действия LPS и пропранолола на клетки.
Таким образом, в заключение можно отметить, что пропранолол вызывает увеличение продукции активных форм кислорода и экспрессии CD 11b/CD 18-рецепторов нейтрофилами в присутствии LPS. Полученные результаты позволяют предположить, что в механизме активации продукции активных форм кислорода нейтрофилами под действием пропранолола важная роль принадлежит p38MAPK и PI-3K.
СПИСОК ЛИТЕРЛТУРЫ
1. Грачев C.B., Пак С.Г., Малов В.А. и др. // Терапевт. архив. 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.