МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 139-146
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 577.122:579.861.043:535.31
ДЕЙСТВИЕ РЕАКТИВИРУЮЩЕГО ФАКТОРА LUTEOCOCCUS JAPONICUS SUBSP. CASEI НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ SOS-ОТВЕТА
© 2013 г. Н. Г. Лойко*, Л. И. Воробьева**, Е. Ю. Ходжаев**, А. Н. Козлова*, В. Ф. Гальченко*, Г. И. Эль-Регистан*
* Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва ** Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 14.06.2012 г.
Изучено действие внеклеточного пептидного реактивирующего фактора (РФ), синтезируемого Luteococcus casei, на стрессовый ответ клеток Escherichia coli, подвергаемых УФ-облучению. В исследованиях использовали сконструированный тестерный штамм, несущий оперон umuD-lacZ, уровень экспрессии которого отражает степень активации SOS-ответа. Защитный эффект РФ, определяемый по численности клеток, сохраняющих колониеобразующую способность (КОЕ) после УФ-об-лучения (49—1166 Дж/м2), был дозозависим, видонеспецифичен и возрастал с увеличением стрессовой нагрузки. Было показано, что РФ обладает функциями прямого адаптогена: 15-минутная предынкубация с ним клеток обусловливала снижение в 1.5—6 раз экспрессии гена umuD SOS-отве-та у УФ-облученных клеток параллельно с увеличением в 1.2—7.5 раз численности оставшихся жизнеспособными (сохранивших колониеобразующую способность) клеток. Возможные механизмы защитного действия РФ обсуждаются.
Ключевые слова: реактивирующий фактор (РФ), Luteococcusjaponicus subsp. casei, стресс, протекция, УФ-облучение, E. coli, SOS-ответ, гибридный umuD-lacZ оперон.
DOI: 10.7868/S0026365613020092
Известно, что существенное изменение любого значимого параметра среды приводит к возникновению у микроорганизмов стрессового состояния, которое диагностируется по торможению метаболической активности клеток и изменению скорости их роста, вплоть до прекращения деления [1, 2]. Индуцирующиеся при этом механизмы адаптации к создавшимся условиям, направленные на сохранение жизнеспособности клеток и выживание популяции включают: изменения в метаболической активности клеток, экспрессию стрессовых генов, увеличение частоты адаптивных мутаций, фазовые вариации и диссоциативные переходы и др. [3—6]. Достаточно подробно изучены внутриклеточные события формирования приспособительных компенсаторных реакций при стрессе голодания, тепловом шоке, у- и УФ-облучении, сопровождающиеся включением механизмов репарации и стабилизации ДНК и экспрессией генов стрессовых регулонов: rpoS, охуЯ, SOS-ответа [5—9]. Система SOS-ответа, включающая экспрессию более 40 генов, в том числе, отвечающих за рекомбинационную репарацию ДНК и контроль деления, индуцируется как реак-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: loikonat@mail.ru).
ция на воздействие факторов, вызывающих появление однонитевых разрывов ДНК или нарушающих ее репликацию, в частности, УФ-облучение [10]. У E. coli рекомбинационную репарацию выполняют специальные ДНК-полимеразы: Pol IV — продукт гена dinP, и Pol V — продукт RecA-зависи-мого гена umuD. Полимеразы обладают низкой точностью, что обусловливает возрастание числа ошибочных репарационных актов в 100 раз и вызывает эффект гипермутабельности для повышения степени выживания популяции [11].
На популяционном уровне в формировании стрессового ответа у микроорганизмов принимают участие внеклеточные низкомолекулярные ауторегуляторы с коммуникативной функцией, обеспечивающие согласованный ответ всей популяции на разнообразные стрессорные воздействия [12]. Известны адаптогенные регуляторы различной химической природы [13—16], в том числе, пептиды, SH-содержащие метаболиты, алкилоксибензолы, а также, реактивирующий фактор (РФ), выделенный впервые из культуры Luteococcus japonicus subsp. casei [17, 18]. В дальнейшем было показано, что РФ синтезируется также Saccharomyces cerevisiae и представителями других видов дрожжей, аккумулируется в среде в
достаточных для функционирования количествах, действует в низких концентрациях, обладает термоустойчивостью и устойчивостью при хранении [17—20]. Действие РФ оказалось неспецифично в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей и проявлялось как в протекции, так и реактивации клеток, подверженных разным стрессорным воздействиям, в том числе, тепловому шоку и УФ-облу-чению [19—21]. Так, предынкубация (10 мин) бактерий с РФ до их последующего прогревания в 5.5 раз увеличивала количество жизнеспособных (КОЕ) клеток [20]. Внесение РФ L. casei в УФ-об-лученную суспензию S. cerevisiae увеличивало выживаемость дрожжей в 2.7 раза [21]. В работе [21] было высказано предположение, что реактивирующее действие РФ связано с включением общих репарационных механизмов, обеспечивающих как ликвидацию повреждений ДНК, так и восстановление целостности цитоплазматической мембраны. При этом механизмы протекторного действия РФ остались неизученными. Протекторные эффекты соединений целесообразно изучать на моделях регуляции SOS-системы [16], действие которой хорошо известно [10, 11].
Цель данной работы состояла в исследовании эффектов РФ в качестве внеклеточного регулятора, контролирующего уровень экспрессии стрессовых генов SOS-системы у модельного штамма E. ^li, содержащего гибридный оперон umuD-lacZ, в нормальных условиях роста и при УФ-облучении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали генетически сконструированный на основе бактерии E. coli С600 thi, thr, leu A(pro-lac) штамм um250 [16]. Клетки E. coli um250 содержат гибридный оперон umuD-lacZ, поэтому штамм является моделью для изучения регуляции экспрессии генов SOS-ответа.
Тестерный штамм um250 выращивали в среде Луриа-Бертрани (LB, 20 г/л, "Sigma", США), содержащей ампициллин (50 мкг/мл), в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) при 30°С на качалке (160 об./мин). Инокулят — культуру стационарной фазы, вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность (ОП) 0.2 (Specord, Германия, X = 450 нм, l = 10 мм).
Количество жизнеспособных клеток определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на агаризованную LB среду.
Реактивирующий фактор (РФ) синтезируется бактерией L. japonicus subsp. casei [17, 18]. Бактерии выращивали в статических условиях при 30°С в глюкозо-минеральной среде следующего
состава(%): глюкоза — 1.5; (NH4)2SO4 — 0.3; KH2PO4 - 0.2; CaCl2 - 0.002; MgSO4 - 0.002; NaCl - 0.002; CoCl2 • 6H2O - 0.001; триптон ("Difco", США) - 0.1; дрожжевой экстракт ("Difco", США) - 0.05; рН 6.8-7.0. Культуру фазы экспоненциального роста центрифугировали (10000 g, 5 мин), отделенную культураль-ную жидкость (1 л) фильтровали через фильтр с размером пор 0.22 мкм ("Nucleopore Corporation", США), адсорбированные на фильтре внеклеточные белки эллюировали 3% NaCl. Солевой раствор белков центрифугировали (10000 g, 5 мин) для гарантированного удаления клеток бактерий, что контролировали высевом раствора в чашки Петри с агаризованной средой выше изложенного состава. Полученный супернатант, содержащий внеклеточные белки, обладающие реактивирующим действием (РФ) лиофилизировали.
Лиофилизированный образец реактивирующего фактора растворяли в 1 мл Z-буфера и использовали в работе в исходной концентрации (РФ) или после разведения в 10 раз (РФ/10).
Влияние РФ на экспрессию генов SOS-ответа изучали, внося в аликвоты (0.9 мл) культур тестер-ного штамма um250 фазы экспоненциального роста (ОП 2.7) растворы РФ или РФ/10 (0.1 мл). Суспензии инкубировали в статических условиях 15 мин. Затем в клетках, дважды отмытых Z-буфе-ром, определяли активность Р-галактозидазы. В контрольных вариантах в пробу (0.9 мл) вносили эквивалентное количество Z-буфера (0.1 мл).
Активность р-галактозидазы в клетках определяли спектрофотометрическим методом при расщеплении субстрата (о-нитрофенил-Р-галакто-пиранозида) с образованием окрашенного продукта [22]. За единицу активности принимали такое количество фермента, стандартно выделенного из клеток 1 мл клеточной суспензии, которое давало увеличение ОП при 420 нм на 1 ед за 1 мин (А, ед/(мин • мл)).
Удельную активность фермента (в пересчете на одну КОЕ) рассчитывали по формуле: удА = А/В, (уд. ед/(мин • клетку)), где:
А - валовая активность фермента Р-галактози-дазы в образце, ед/(мин • мл);
В - количество жизнеспособных клеток (КОЕ) в образце, клетка/мл.
Протекторные свойства РФ изучали, подвергая предынкубированные (15 мин) с РФ или РФ/10 и контрольные (без воздействия РФ) клетки те-стерного штамма УФ-облучению в разных дозах, и затем определяя в них активность Р-галактози-дазы.
УФ-облучение клеток проводили тремя способами с использованием ртутной лампы высокого давления БУВ 30 РДН-100 (X = 251 нм, расстояние до источника облучения 25-100 см, энергети-
Таблица 1. Влияние РФ на количество клеток и активность галактозного оперона umuD-lacZтестерного штамма E. coli um250
Образец Измеряемый параметр Вариант
Контроль РФ РФ/10
Культура КОЕ х 108 6.3 6.5 6.4
Суспензия в /-буфере 3.8 4.3 4.5
Культура Суспензия в /-буфере Активность в-галактозидазы, ед/(мин • мл) 39.9 22.4 49.4 29.7 46.7 31.0
Культура Суспензия в /-буфере Удельная активность галактозидазы, ед/(мин • клетка) 6.3 5.9 7.6 6.9 7.3 6.9
ческая освещенность образцов составляла 0.405— 1.62 Вт/м2).
1) Облучению подвергали контрольные и опытные образцы, в которых клетки находились в куль-туральной среде, в закрытых пластмассовых эппен-дорфах, что создавало дополнительную защиту от УФ-излучения. Энергетическая освещенность образцов составляла 0.405 Вт/м2, дозы облучения в зависимости от времени облучения — 5, 10, 20 мин, составили 121.5, 243 и 486 Дж/м2, соответственно.
2) Облучению подвергали контрольные и опытные образцы, в которых клетки находились в среде роста в открытых чашках Петри при максимальной доступности для УФ-облучения. Дозы облучения в зависимости от времени облучения — 2, 6 и 12 мин, составили 194.4, 583.2 и 1166.4 Дж/м2, соответственно.
3) Облучению подвергали контрольные и опытные образцы, в которых клетки, отмытые от среды роста и ресуспендированные в Z-б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.