МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 213-223
К 100-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ A.A. БАЕВА ОНКОГЕНОМИКА =
УДК 577:616.006
ДИАГНОСТИКА ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ ПРИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
© 2004 г. Д. В. Залетаев1'2'*, М. В. Немцова1'2, В. В. Стрельников12, О. В. Бабенко1'2, Е. В. Васильев1, В. В. Землякова1, А. И. Жевлова1, О. В. Дрозд1
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук,
Москва, 115478
2Научно-исследователъский институт молекулярной медицины при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 119992 Поступила в редакцию 09.09.2003 г.
Представлены результаты изучения эпигенетических нарушений и методы их диагностики при некоторых наследственных и онкологических заболеваниях. Аномальное метилирование промотор-ных и регуляторных районов генов приводит к их функциональной инактивации, равноценной структурной делеции. Разработаны скрининговые подходы к диагностике синдромов Прадера-Вил-ли, Ангельмана, Видеманна-Беквита, Мартина-Белл и неспецифической умственной отсталости РЯАХЕ, основанные на анализе аллельного метилирования посредством метилспецифической и ме-тилчувствительной полимеразной цепной реакции. Показано, что метилирование таких генов, вовлеченных в канцерогенез, как ЯБ1, СОКЫ2Л, АЯГ14, Н1С1, СЭ1 и др., является частым событием в опухолях, причем различные типы опухолей отличаются по частоте метилирования этих генов, что создает основу для дифференциальной диагностики. Поскольку аномальное метилирование генов-су-прессоров опухолевого роста считается одним из наиболее ранних событий злокачественной трансформации, этот маркер может использоваться для досимптоматической диагностики опухолей.
Ключевые слова: эпигенетическая патология, метилирование, импринтированные районы, наследственные синдромы, канцерогенез, гены-супрессоры, СрО-островок.
ВВЕДЕНИЕ
Молекулярные основы наследственной патологии являются наиболее изучаемой проблемой медицинской и молекулярной генетики. Развитие этой области науки показало, что расшифровка нуклеотидной последовательности - это только один из первых шагов к пониманию закономерностей функционирования генома в целом. Изучение особенностей структурной организации ДНК определенных хромосомных районов, ее модификаций, регуляции и взаимодействия "оркестра" генов на разных стадиях онтогенеза, а также в норме и при патологии, потребует еще немало усилий.
Наши исследования в области молекулярно-генетической патологии показали, что картирование гена-кандидата определенного заболевания в хромосомном локусе, его клонирование и обнаружение специфических мутаций, даже при условии отсутствия генетической гетерогенности заболевания, во многих случаях не позволяет осу-
Принятые сокращения: МС-ПЦР - метилспецифическая полимеразная цепная реакция, МЧ-ПЦР - метилчувстви-тельная полимеразная цепная реакция.
* Эл. почта: zalnem@online.ru
ществлять абсолютно точную диагностику [1-3]. Причина этого - достаточно распространенные, но недостаточно изученные у человека явления импринтинга, эффекта положения и особенности структурно-функциональной организации хроматина в определенном хромосомном локусе. Все эти причины классифицируются как эпигенетические и обозначают наследственные и ненаследственные изменения экспрессии гена без каких-либо изменений его нуклеотидной последовательности. Возникновение такой патологии обусловлено аномалиями метилирования промотор-ных и регуляторных областей гена, динамическими (амплификация микросателлитных повторов) и точковыми мутациями в регуляторных областях генов и т.д. [4].
Известно, что метилирование ДНК участвует во многих процессах, в том числе в регуляции экспрессии тканеспецифичных генов, клеточной дифференцировке, геномном импринтинге, инактивации Х-хромосомы, регуляции структуры хроматина, репликации ДНК, канцерогенезе и старении. Среди причин возникновения некоторых наследственных и онкологических заболеваний все большая роль отводится эпигенетической регуляции активности генов, основанной на аномальном
метилировании CpG-островков в промоторных районах, что приводит к их полной инактивации. Таким образом, при отсутствии каких-либо изменений нуклеотидной последовательности ген теряет свою активность, что может рассматриваться как функциональная делеция [5, 6].
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ПАТОЛОГИИ ИМПРИНТИРОВАННЫХ РАЙОНОВ
Анализ аллелъного метилирования локусов хромосомного района 15(q11-q13) при синдромах Прадера-Вилли и Ангелъмана
Один из наиболее изученных импринтирован-ных районов - сегмент хромосомы 15 (q11.2-q13). Все импринтированные районы генома человека характеризуются моноаллельной экспрессией генов, подверженных импринтингу [7]. Структурная и функциональная патология этого участка фенотипически проявляется хорошо известными синдромами Прадера-Вилли (MIM 176270) и Ан-гельмана (MIM 105830).
Поскольку развитие синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана обусловлено потерей функции генов критического района 15q11-q13 на отцовской и материнской хромосомах соответственно, а экспрессия генов в этой области строго соотносится с характером метилирования ДНК, молекулярная диагностика заболеваний может быть основана на различиях в метилировании некоторых локусов критического района на отцовской и материнской хромосомах.
Отцовское гипометилирование и материнское гиперметилирование локусов D15S63 (PW71), D15S9 (ZNF127) и промоторной области гена SNRPN согласуются с отцовской аллель-специфичной активностью большинства импринтиро-ванных генов критического района. Анализ ал-лельного метилирования любого из этих локусов может быть положен в основу ДНК-диагностики синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана. При синдроме Прадера-Вилли независимо от его причины (отцовская делеция, материнская однороди-тельская дисомия или мутация центра имприн-тинга) наблюдаются только метилированные аллели перечисленных локусов, а для синдрома Ангельмана (кроме точковых мутаций в гене-кандидате UBE3A) характерно присутствие только не-метилированных аллелей этих же локусов [8, 9].
До недавнего времени ДНК-диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана основывалась на анализе дифференциального метилирования с использованием блот-гибридизационного анализа [8, 10]. При этом применяли метилчувстви-тельные рестриктазы и ДНК-зонды, соответствующие дифференциально метилированным районам. Метилчувствительные рестриктазы расщепляют
только ДНК, содержащую неметилированный остаток цитозина в сайте узнавания. Промоторная область гена SNRPN на отцовской хромосоме не метилирована, поэтому при обработке метилчув-ствительными рестриктазами происходит гидролиз отцовской ДНК по неметилированным сайтам рестрикции. На материнской хромосоме в сайтах рестрикции остатки цитозина подвержены метилированию, поэтому материнский аллель устойчив к гидролизу метилчувствительными рест-риктазами.
Отцовский аллель после гидролиза метилчув-ствительной рестриктазой имеет меньшую длину по сравнению с материнским. У здоровых лиц наблюдаются два гибридизационных сигнала, соответствующие двум родительским аллелям. Присутствие только тяжелого (метилированного материнского) или только легкого (неметилированного отцовского) аллеля свидетельствует о структурном или функциональном нарушении критического района 15q11-q13, которое приводит к развитию синдрома Прадера-Вилли или синдрома Ангельмана соответственно [8, 9].
В последнее время получил распространение метод анализа метилирования ДНК, основанный на модификации геномной ДНК бисульфитом натрия. В ходе реакции неметилированные остатки цитозина превращаются в урацил, тогда как 5-ме-тилцитозин не модифицируется. По изменению нуклеотидного состава после обработки бисульфитом натрия можно судить о состоянии метилирования каждого цитозинового остатка в образце ДНК.
Модификация ДНК бисульфитом натрия приводит к появлению различий в нуклеотидном составе районов дифференциального метилирования материнской и отцовской копий гена SNRPN. Это позволяет подобрать праймеры таким образом, чтобы их отжиг и длина продукта амплификации зависели от метилирования анализируемого локуса [11].
При амплификации ДНК здоровых людей образуются фрагменты, длина которых соответствует двум родительским аллелям (рис. 1). При синдроме Прадера-Вилли длина продукта пЦр соответствует только метилированному (материнскому) аллелю, а в случае синдрома Ангельмана - только неметилированному (отцовскому) аллелю.
Метилирование промоторной области гена SNRPN у каждого больного анализировали двумя способами с применением двух наборов прайме-ров. В первом случае использовали набор из трех праймеров, один из которых - "общий" - отжигается на последовательности, не содержащей CG-ди-нуклеотидов, т.е. на обоих родительских аллелях независимо от их метилирования. В ходе первого цикла ПЦР в продолжение "общего" праймера синтезируется полинуклеотидная цепь, на которой в
последующих циклах отжигаются остальные два праймера - "материнский" и "отцовский". Благодаря различиям в нуклеотидном составе, возникшим на родительских аллелях после бисульфит-ной обработки, "материнский" праймер отжигается на метилированной (в норме материнской) ДНК, а "отцовский" - на неметилированной (в норме отцовской) ДНК. "Материнский" и "отцовский" праймеры в паре с "общим" дают продукты амплификации длиной 313 и 221 п.н. соответственно [11, 12].
Второй вариант диагностики - ПЦР с двумя парами праймеров, "Ме1" и "Unmet", которые избирательно отжигаются на метилированной и неметилированной последовательностях, что соответствует материнской и отцовской хромосомам. В реакциях с праймерами "МеГ' и "Unmet" образуются фрагменты длиной 131 и 164 п.н. (рис. 1).
Результаты диагностики больных синдромами Прадера-Вилли и Ангельмана и здоровых доноров, полученные обоими методами - с двумя парами праймеров и в трехпраймерной системе, полностью совпадают.
У 200 больных с клиническим диагнозом синдром Прадера-Вилли и 110 больных с клиническим ди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.