ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 686-691
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1.036
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В РАСТЕНИИ ОГУРЦА В ОТВЕТ НА МНОГОКРАТНЫЕ КРАТКОВРЕМЕННЫЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
© 2007 г. Е. Ф. Марковская, М. И. Сысоева, Е. Г. Шерудило, Л. В. Топчиева
Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук, Петрозаводск
Поступила в редакцию 11.10.2006 г.
Вопрос о механизмах реакции растений на многосуточное кратковременное низкотемпературное воздействие в период активной вегетации растений до настоящего времени остается открытым. Изучали 6-дневное влияние кратковременного (на 2 ч в конце ночного периода - ДРОП) и длительного (постоянного в течение суток - ПНТ) снижения температуры до 12°С на холодоустойчивость и изменения в экспрессии генов у растений огурца (Cucumis sativus L.). Сравнивали растения двух опытных вариантов и контрольные, выращенные без низкотемпературных воздействий при 20°С. Холодоустойчивость растений определяли по методу ЛТ50. Реакцию генетического аппарата растений огурца оценивали с помощью метода дифференциального дисплея, основанного на полимераз-ной цепной реакции (ПЦР). Об изменении пула мРНК в клетках растений огурца судили после сравнения ПЦР-фрагментов кДНК в условиях ПНТ и ДРОП. Отмечено увеличение холодоустойчивости в обоих вариантах опыта, начиная со вторых суток действия низкой температуры. В конце опыта (на 6-е сутки) прирост холодоустойчивости при ДРОП был в 3 раза выше, чем при ПНТ. Анализ пула мРНК в разных вариантах опыта показал, что число амплифицированных фрагментов близко в обоих вариантах низкотемпературного воздействия. Высказана гипотеза, что более высокий уровень холодоустойчивости при ДРОП по сравнению с ПНТ связан с особенностями метаболизма.
Cucumis sativus - низкая положительная температура - холодоустойчивость - механизмы устойчивости - ПЦР-анализ - дифференциальный дисплей
ВВЕДЕНИЕ
По современным представлениям, одним из механизмов реакции растений на ежедневное кратковременное снижение температуры (ДРОП) является ингибирование синтеза гиббереллинов [1], что хорошо объясняет морфогенетический эффект, полученный при использовании этого приема на различных видах растений [2, 3]. В ответ на воздействие ДРОП отмечается повышение холодоустойчивости растений, причем величина прироста холодоустойчивости в 2-3 раза выше, чем в опытах с использованием постоянного в течение суток действия низкой положительной (закаливающей) температуры (ПНТ) [4, 5]. Известно, что холодоустойчивость растений находится под контролем генетического аппарата, и ее повышение в ходе длительного низкотемпературного закали-
Сокращения: ДРОП - кратковременное снижение температуры (от англ. drop), ПНТ - положительная низкая температура, ПЦР - полимеразная цепная реакция. Адрес для корреспонденции: Сысоева Марина Ивановна. 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11. Институт биологии Карельского НЦ РАН. Факс: 007 (8142) 76-98-10; электронная почта: sysoeva@krc.karelia.ru
вания связано с изменением экспрессии генов и индукцией синтеза стрессовых белков [6-12]. Вопрос об изменении экспрессии генов в растительной клетке при воздействии ДРОП остается открытым. В связи с этим, в задачу исследования входил сравнительный анализ пула матричной РНК в виде фрагментов кДНК из листьев растений огурца, подвергнутых воздействию ПНТ и ДРОП.
МЕТОДИКА
Семена огурца (Cucumis sativus L., гибрид Зозуля) проращивали в чашках Петри в термостате при 28°С в течение 2 суток, затем высаживали в вазоны с песком (поливали питательным раствором Кнопа с добавлением микроэлементов, рН 6.2-6.4) и помещали в камеры искусственного климата. Относительная влажность воздуха составляла 60-70%, интенсивность света 100 Вт/м2 при освещении лампами ДРЛ-400 и 12-часовом световом дне. До начала эксперимента растения выращивали в оптимальных условиях: 2 суток при 30°С до выноса семядолей над поверхностью субстрата и 2 суток при 23°С до полного раскрытия семядолей [13]. По достижении фазы полно-
Таблица 1. Динамика прироста холодоустойчивости листьев огурца при ежесуточном кратковременном (ДРОП) и постоянном (ПНТ) действии низкой температуры
Прирост холодоустойчивости (ДЛТ50), °С
Вариант 1 сутки 2 суток 3 суток 5 суток 6 суток
до воздействия после воздействия
ДРОП ПНТ 0 0.1 0.6 1.5 0.6 2.2 0.8 2.7 2.8 0.7
Примечание. Уровень холодоустойчивости клеток листа к 5 мин промораживанию в контроле равен -10.0°С.
стью раскрытых семядолей растения подвергали в течение 6 суток низкотемпературным обработкам: выращивали при постоянной суточной температуре 12°С (вариант постоянной низкой температуры - ПНТ) или снижали температуру до 12°С на 2 ч в конце ночи (вариант ДРОП, кратковременное снижение температуры). Растения контрольного варианта оставались при температуре 20°С на протяжении всего эксперимента. К концу опыта растения всех вариантов находились в фазе полностью развернутого 1-го настоящего листа. Для анализа брали следующие образцы растений: контроль - перед началом опыта и по окончании 6 суток; ПНТ - по окончании 1-, 2-, 3- и 6-х суток; ДРОП - по окончании 1-, 3-, 5- и 6-х суток низкотемпературного воздействия, а также в динамике (действие и последействие) в течение вторых суток. Холодоустойчивость растений определяли при помощи метода ЛТ50 [14].
Для экстракции мРНК навеску листьев (50 мг) растирали в жидком азоте с добавлением 400 мкл лизирующего буфера ("Силекс"), содержавшего 2%-ный меркаптоэтанол. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием. К суперна-танту добавляли 800 мкл буфера для разведения и вносили биотин-меченный о^о^Т) праймер (68 пмолей). После центрифугирования суперна-тант вносили в пробирку с магнитными частицами, покрытыми стерптавидином. Магнитные частицы собирали с помощью магнитного штатива, тщательно отбирали супернатант. Поли(А)-со-державшую РНК элюировали стерильной водой, свободной от РНКаз при температуре 70°С.
Для анализа изменений в экспрессии генов использовали метод дифференциального дисплея [15]. Первую цепь кДНК синтезировали на по-ли(А)+РНК (0.5 мкг), используя о^о^Т)15 праймер и M-MLV обратную транскриптазу (набор ОТ-ПЦР (обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция) фирмы "Силекс"). Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с 6 декамерными случайными праймерами ("Син-тол") (5'-GTAGCTGACG-3'; 5'-GTGTCGAGTC-3'; 5'-AGGTCTGACG-3'; 5'-CAGTAGCGTC-3'; 5'^ТС-GATCGAG-3'; 5'-CGAGCCGATC-3'; 5'-GCAGCT-CAGC-3') и о^о^Т)15 праймером. Реакционная
смесь для ПЦР в объеме 30 мкл содержала кДНК, по 0.2 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифос-фатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), по 100 пМ случайного праймера и праймера, используемого при синтезе первой цепи, 1 ед. Taq-полимеразы. Условия ПЦР: денатурация - 2 мин при 94°С, отжиг -1 мин при 37°С, полимеризация - 1 мин при 72°С; количество циклов - 35; достраивание фрагментов - 10 мин при 72°С. ПЦР продукты разделяли в 1.8%-ном агарозном геле, используя Трис-бо-ратный буфер. ПЦР продукты окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ свете. Амплифицированные фрагменты кДНК, полученные из мРНК опытных образцов, сравнивали с фрагментами из контрольного образца растений, не подвергнутых неблагоприятному температурному воздействию. Изображение гелей анализировали с помощью программы Kodak 1D.
Всего было проведено два независимых опыта в 10-кратной биологической повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Увеличение холодоустойчивости листьев проростков огурца отмечали у растений обоих вариантов низкотемпературного воздействия, начиная со вторых суток (табл. 1). Наиболее существенные различия в значениях прироста холодоустойчивости выявлены к концу 6-х суток: в варианте ДРОП эта величина была в 3 раза выше, чем при постоянном действии низкой закаливающей температуры. Для оценки изменений пула мРНК в клетках растений огурца в ходе температурного воздействия проводили сравнительный анализ ПЦР-фрагментов кДНК растений, подвергнутых воздействию ПНТ и ДРОП (рисунок). В ходе ПЦР-анализа амплифицировались продукты от 100 до 1400 п.н., при этом количество амплифици-рованных фрагментов кДНК варьировало от 58 до 96 в зависимости от варианта опыта (табл. 2). Анализ динамики изменений количества фрагментов кДНК в вариантах ПНТ и ДРОП свидетельствует о возрастании их общего количества в 1- и 2-е сутки экспозиции растений как в условиях ПНТ, так и при воздействии ДРОП. К концу 3-х суток пул мРНК уменьшался в растениях обоих
п.н.
1500
1000 800 700 600 500
400 300
200
М 1
ПЦР-фрагменты кДНК, полученные на мРНК, выделенной из клеток растений огурца при ежесуточном кратковременном (ДРОП) и постоянном (ПНТ) действии низкой температуры. Для амплификации фрагментов использован оИ-go(dT)15 и 5'-CGAGCCGATC-3' праймер.
М - маркеры молекулярной массы, 1 - контроль (1-е сутки); 2 - ДРОП (1-е сутки), 3 - ДРОП (2-е сутки, до воздействия), 4 - ПНТ (2-е сутки); 5 - ДРОП (2-е сутки, после воздействия), 6 - ПНТ (1-е сутки), 7 - ПНТ (3-и сутки), 8 -ДРОП (5-е сутки), 9 - ПНТ (6-е сутки), 10 - контроль (6-е сутки), 11 - ДРОП (6-е сутки).
вариантов, сохраняя эту тенденцию до конца опыта. Выявленные в обоих вариантах изменения в экспрессии генов проходили на фоне возрастания уровня холодоустойчивости проростков (табл. 1). Следует также отметить, что наблюдаемое повышение холодоустойчивости растений сопровождалось и появлением в их клетках новых транскриптов (табл. 2). При этом динамика их индукции была аналогична изменениям общего пула мРНК и находилась в прямой корреляции с ро-
стом холодоустойчивости в начальный (1-2-е сутки) период низкотемпературного воздействия и в обратной корреляции - в последующие сутки. Можно полагать, что рост холодоустойчивости в условиях ПНТ и ДРОП сопровождается изменением экспрессии генов и появлением новых фрагментов кДНК, что особенно заметно в первые сутки действия низкой температуры. В последующие сутки, когда холодоустойчивость выходит на свой максимальный уровень (вариант ПНТ, табл. 1)
Таблица 2. Амплифицированные фрагменты кДНК, полученные на мРНК из листьев огурца при ежесуточном кратк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.