ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 3, с. 422-428
УДК 581.1
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ПРИ ОРГАНОГЕНЕЗЕ ТОМАТА in vitro
© 2004 г. X. Шан, С. В. Ли, Д. Ли, С. Шао, Б. Лиу
Институт генетики и цитологии, Северовосточный нормальный университет, Чанчунь, Китай
Поступила в редакцию 15.08.2003 г.
Каллусообразование и регенерация растений путем органогенеза были индуцированы в семядолях проростков томата (Lycopersicon esculentum L., сорт Jia Fen-10). Анализировали состав и содержание специфичных для разных стадий развития белков. Также сравнивали состав и содержание белков эмбриогенных и неэмбриогенных каллусов. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с последующим лазерным сканированием позволил обнаружить белки, специфичные для разных стадий развития. Среди них 6 белков (61, 54, 38, 37, 35 и 23 кД) были связаны с морфогенезом органов, а 2 белка (39 и 24 кД) - с морфогенезом каллусов. На разных стадиях развития эмбриоген-ного каллуса не было замечено различий в составе белков, но проявлялась тенденция к изменениям количества как белков 39 и 24 кД, так и общего белка. Эмбриогенный и неэмбриогенный каллусы различались по составу и по содержанию белка. Например, белок 54 кД был найден в неэмбриоген-ном, но не в эмбриогенном каллусе. Общее содержание белка было выше в эмбриогенном каллусе.
Lycopersicon esculentum - органогенез - специфические белки - содержание белка
Для понимания молекулярных основ органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре растительной ткани в последнее время многие исследователи перешли от морфологических наблюдений к молекулярно-биологическим исследованиям, в частности, к анализу специфических белков.
Заметный прогресс достигнут в отношении молекулярного механизма соматического эмбриогенеза [1, 2], но гораздо меньше известно о молекулярных изменениях, сопровождающих органогенез растений в условиях in vitro.
В данной работе мы индуцировали образование каллусов на семядолях проростков томата и регенерацию растений посредством органогенеза. Мы сравнивали содержание и состав белков специфичных для стадий дедифференцировки, редифференцировки и регенерации растений. Кроме того, мы исследовали состав и содержание белков эмбриогенного и неэмбриогенного каллусов. Эта работа может оказаться существенной для дальнейшего изучения генетических и моле-
Сокращения: OD - оптическая плотность. Адрес для корреспондениции: Li X.W. Institute of Genetics and Cytology, Northeast Normal University, Changchun, 130024 People's Republic of China. E-mail: lixw924@nenu.edu.cn
кулярных механизмов регуляции органогенеза растений.
МЕТОДИКА
Культура ткани
Экспланты. В качестве эксплантов использовали семядоли томата (Ьусорвшеоп esculentum Ь., сорт Ла Беп-10).
Культура ткани и регенерация растений. После стерилизации семядоли помещали на среду для индукции каллуса и редедифференциации (МС-среда, с добавлением 0.05 мг/л ИУК, 1.0 мг/л БАП, 3% сахарозы и 7% агара, рН 5.8-6.2). Через 10 сут инкубации в темноте на семядолях появлялись каллусы. Если семядоли с каллусами переносили в условия непрерывного освещения, за 25 сут каллусы покрывались многочисленными почками побегов. Весь процесс культивирования протекал при 25 ± 1°С. Когда почки вырастали в пробирках в 1.5-сантиметровые растеньица, эти растеньица можно было отделить от каллуса и посадить на среду для укоренения (0.5 МС + 1 мг/л индолил-масляной кислоты + 3% сахарозы + 7% агара, рН 5.8-6.2). После полного развития корневой системы регенерированные растения пересаживали в почву. Растения вырастали до полной зрелости и регулярно плодоносили.
Анализ специфических белков в культуре ткани
Растительный материал. Для анализа были использованы семядоли на разных стадиях дедиф-ференцировки, каллусы на разных стадиях ре-дифференцировки, пробирочные растеньица в конце редифференцировки, а также корни, листья и стебли регенерированных растений. Для сравнения эмбриогенных и неэмбриогенных каллусов были выбраны каллусы не способные к ре-дифференцировке (неэмбриогенные) и с высокой способностью к редифференцировке (эмбриоген-ные). Все пробы сначала взвешивали, а затем хранили при -20°С.
Экстракция растворимых белков. Растительный материал растирали в ступке в жидком азоте до тонкого порошка, который переносили в пробирки Эппендорфа, добавляли 0.05 М фосфатный буфер (рН 7.5) в соотношении 1 : 2 (объем/вес) и центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость центрифугировали при той же скорости повторно и использовали для анализа растворимых белков.
Определение концентрации и содержания растворимых белков. Общая концентрация белка (мкг/мкл) = 1.55 OD280 - 0.76 OD260, где OD - оптическая плотность; общее содержание белка (мкг/мг) = общая концентрация белка (мкг/мкл) х х объем фосфатного буфера (мкл)/сырой вес материала (мг); содержание индивидуального белка (мкг/мг) = общее содержание белка (мкг/мг) х х процентное содержание данного белкового компонента [3].
Денатурирующий электрофорез в полиакри-ламидном геле. Краска мигрировала по концентрирующему гелю (5%) при напряжении 50 В и его доводили до 120 В при электрофорезе в разделяющем геле (13.5%). Гель окрашивали 0.25% Ку-масси ярко-голубым R-250 в растворе, содержащем 10% ледяной уксусной кислоты, 25% этанола и 65% деионизированной воды, в течение 4 ч или более. Затем гель отмывали от краски в растворе, содержащем 10% ледяной уксусной кислоты, 25% этанола и 65% деионизированной воды, пока он не становился прозрачным с ясно различимыми полосками белков.
Сканирование и анализ результатов электрофореза. Гели сканировали с помощью лазерного денситометра и анализировали результаты так, как рекомендовано производителем ("Pharmacia LKB", Швеция).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Экспрессия специфических белков на разных стадиях развития
Экспрессия специфических белков при культивировании тканей томата. На стадии дедиффе-ренцировки 61-кД белок был найден только в се-
мядолях, в то время как 54-кД белок присутствовал в семядолях и в набухших семядолях (рис. 1). При начале каллусообразования по краям набухших семядолей появилось два новых белка (39 и 24 кД), а 54-кД белок исчез (рис. 1).
При редифференцировке каллуса (рис. 2) не было замечено различий в составе белков эмбри-огенного каллуса: 39- и 24-кД белки присутствовали на всех стадиях редифференцировки. Однако пробирочные растения заметно отличались по белковому составу: 39- и 24-кД белки исчезали, появлялся белок 54-кД и три новых белка с мол. м. 37, 35 и 23 кД.
На стадии регенерации растений эти три новых белка (37, 35 и 23 кД) специфически распределялись по органам (рис. 3). Так, в листьях присутствовали все три белка, а в стебле был найден еще один белок с мол. м. 38 кД. В корне присутствовали только 37- и 38-кД белки. Белок 54-кД был также найден в стеблях, листьях и корнях регенерированных растений.
Сравнение белков эмбриогенного и неэмбрио-генного каллуса. Рис. 4 показывает, что 54-кД белок присутствовал в неэмбриогенном, но не в эм-бриогенном каллусе. Напротив, 39- и 24-кД белки были найдены в обоих типах каллуса, хотя их не было в пробирочных растеньицах и регенерированных растениях.
Изменения в содержании белков при культивировании тканей томата
Изменения в содержании белков в процессе образования и редифференцировки эмбриогенного каллуса. В начале дедифференцировки каллусы появляются по краям набухших семядолей. Если они развиваются в эмбриогенные каллусы, при оптимальных условиях они могут редиффе-ренцироваться и регенерировать растеньица. Несмотря на то, что при образовании эмбриогенного каллуса не было существенных изменений в составе белков, на разных стадиях развития каллуса заметно менялось количество белков 39- и 24-кД, а также общего растворимого белка.
При образовании и редифференцировке содержание 39- и 24-кД обнаруживало тенденцию к зеркальным изменениям, т.е. когда один белок накапливался, содержание второго снижалось, и наоборот (рис. 5).
Содержание общего белка снижалось при развитии эмбриогенного каллуса (рис. 6). В конце редифференцировки оно было наименьшим.
Сравнение содержания белка в эмбриогенном и неэмбриогенном каллусе. Эмбриогенный и не-эмбриогенный каллусы различались не только по составу, но и по содержанию белка (таблица). Содержание общего белка в эмбриогенном каллусе было равно 9.50 против 2.29 мкг/мг в неэмбрио-
31 кД
43 кД 66 кД
20^кД
97укД
м
кД 97
66 43
31
20
кД
61 54
<-39
«-24
м 1 2 3 4
Рис. 1. Электрофореграммы и лазерные денситограммы растворимых белков на стадии дедифференцировки. 1 - семядоли; 2 - набухшие семядоли; 3 - семядоли с небольшим количеством каллусов; 4 - семядоли с большим количеством каллусов. М - маркер.
генном каллусе. Содержание белков 39- и 24-кД в эмбриогенном каллусе было соответственно в 6 и 7 раз выше, чем в неэмбриогенном каллусе. И, наконец, содержание неспецифических белков (21, 31, 33 и 36 кД) также было выше в эмбриогенном каллусе. Например, содержание 36-кД белка в эмбриогенном каллусе было выше в 3 раза, чем в неэмбриогенном.
ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения в составе и количестве специфических белков на различных стадиях развития
Многие исследователи интересуются регуля-торными механизмами соматического эмбриогенеза. Основная причина заключается в том, что
Содержание белка в эмбриогенном и неэмбриогенном каллусах (мкг/мг сырого веса)
Каллус Общий белок Специфические белки Неспецифические белки
24 кД 39 кД 21 кД 31 кД 33 кД 36 кД
Неэмбриогенный Эмбриогенный 2.29 9.50 0.05 0.35 0.14 0.84 0.31 0.91 0.25 0.39 0.28 0.59 0.19 0.81
31, кД
43 кД
66 кД
20 кД
97 , кД
135 кД
, 54 кД
37 кД 1
М
66
43
кД
31
20
54
24 23
М 12 3
Рис. 2. Электрофореграммы и лазерные денситограммы растворимых белков на стадии редифференцировки. 1 - каллусы в начале дедифференцировки; 2 - каллусы вокруг зеленых точек; 3 - каллусы вокруг почек побегов; 4 -каллусы вокруг пробирочных растений; 5 - пробирочные растения. М - маркер.
эмбриоиды на разных стадиях развития легко различить по их морфологии, что удобно для взятия проб. Однако не все растен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.