научная статья по теме ДИКАРБОКСИЛАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ПЕРЕНОСИТ ЦИТРАТ И МОДУЛИРУЕТСЯ КАТИОНАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ДИКАРБОКСИЛАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ПЕРЕНОСИТ ЦИТРАТ И МОДУЛИРУЕТСЯ КАТИОНАМИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 446-457

УДК 577.152.1

ДИКАРБОКСИЛАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ Saceharomyees eerevisiae ПЕРЕНОСИТ ЦИТРАТ И МОДУЛИРУЕТСЯ КАТИОНАМИ

© 2008 г. Д. А. Аливердиева, Д. В. Мамаев*, Д. И. Бондаренко*

Прикаспийский институт биологических ресурсов ДНЦ РАН, 367000 Махачкала; электронная почта: dinara_inbi@mail.ru *Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, 119071 Москва, Россия Поступила в редакцию 17.06.2008 г.

Исследовали транспорт сукцината и цитрата в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, измеряя скорость их окисления клетками и используя не проникающие через плазмалемму эффективные конкурентные ингибиторы этого окисления - О-пальмитоил-Ь-малат и 2-ундецилмалонат. Линейность ингибирования в координатах Диксона свидетельствовала о том, что 2-ундецилмалонат подавлял лимитирующую стадию в окислении обоих субстратов. Поскольку ингибитор непроникающий, скорость окисления исследованных субстратов лимитируется скоростью их транспорта через плазмалемму. Использованный методический подход позволял за 30-40 мин измерить кинетические параметры транспортера в одной пробе, контролируя в той же пробе сохранение лимитирующих условий. Vmax окисления сукцината зависела от рН, монотонно возрастая от почти нулевых значений при рН 4.5 до максимальных при рН 7.5. При рН 5.5 транспорт обоих субстратов был нечувствителен к действию протонофора FCCP, активировался в присутствии ионов Na+, конкурентно ингибировался ионами К+ и характеризовался близкими величинами констант конкурентного ингибирования 2-ундецилмалонатом. Это позволило предположить, что оба субстрата поступают в дрожжевую клетку через общий переносчик плазмалеммы, что не характерно для транспортеров плазмалеммы грибов. При рН 6.5 катионы триса, K+, Na+ не влияли на скорость окисления сукцината. Величина Км для сукцината уменьшалась при увеличении рН мононатриевой среды параллельно с ростом доли дианионной формы субстрата. Обсуждаются необычная субстратная специфичность и механизм транспорта дикарбоксилатов через плазмалемму клетки S. cerevisiae.

В последние годы исследователи уделяют большое внимание проблеме транспорта дикарбоксилатов (ДКБ) через плазматическую мембрану клеток животных, растений и бактерий [1-3]. В то же время соответствующие транспортеры дрожжей изучены недостаточно. Ранее мы показали, что плазматическая мембрана Saccharomyces cerevisiae осуществляет перенос ДКБ (сукцината и, с большой вероятностью, Ь-малата и малоната) по механизму, исключающему симпорт субстрата с протоном [4], что нетипично для ДКБ транспортеров дрожжей [5-7]. При рН 5.5 окисление сукцината клетками S. cerevisiae существенно активнее в среде с но не К+ , что позволило предположить возможность симпорта сукцината с [4], аналогично переносчикам плазмалеммы животных [1]. Есть основания предполагать, что при определенных условиях на плазмалемме S. cerevisiae может создаваться градиент ионов Ка+ за счет, возможно, совместного действия Н+-АТР-азы и Ка+/Н+-анти-портера [8], которые есть в плазмалемме S. cerevi-siae (обзор [9] и ссылки в нем), а при высоких концентрациях КаС1 - и Ка+-АТР-азой [10]. Переносчик Schizosaccharomyces pombe связывает субстрат (Ь-малат) в моноанионной форме [5], а, согласно

нашим предварительным данным, сукцинат транспортируется в клетку S. cerevisiae в том числе в форме дианиона. Ранее мы показали способность переносчика плазмалеммы S. cerevisiae транспортировать сукцинат, ¿-малат [4] и взаимодействовать с фумаратом [11]. Кроме того, установлено, что при инкубации клеток при 0°С в цитоплазме накапливался ¿-малат [12]. Показано, что клетки S. cerevisiae с "поврежденным" циклом Кребса выбрасывают в среду культивирования накапливающиеся в цитоплазме сукцинат, ¿-малат, фумарат, а также цитрат [13]. Транспорт цитрата ДКБ транспортером не характерен для переносчиков грибов. Представляет интерес ответ на вопрос: опосредован ли выброс цитрата и сукцината из клеток общим переносчиком или в плазмалемме S. cerevisiae существует цитратный транспортер?

Цель настоящей работы - исследование транспорта сукцината и цитрата через плазмалемму S. cerevisiae, изучение влияния специфического ингибитора, величины рН и содержания катионов в среде инкубации на кинетические параметры транспорта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штамм, условия выращивания и подготовка клеток. В работе использовали тетраплоидный штамм S. cerevisiae Y-503 [14]. Дрожжи выращивали в 750 мл качал очных колбах (орбитальный шейкер, 220 об/мин) при 28°С в 100 мл среды, содержавшей 0.2% дрожжевого экстракта, 0.21% КН2Р04 (pH 4.5) и 0.1% глюкозы. Инокулят, выращенный в той же среде, но с 1% глюкозы, вносили в среду c тем расчетом, чтобы исходная мутность суспензии составляла не более 0.1 ед. поглощения при 540 нм. Часть опытов была проведена на клетках, выращенных в синтетической среде на основе Yeast nitrogen base (YNB), содержащей YNB (0.17%), KH2PO4 (0.1%), аспарагин (0.1%) и глюкозу (0.1%). Среда инокулирования в этих опытах не содержала KH2PO4, но концентрация глюкозы составляла 1%. Через 10 ч выращивания клетки быстро (3-5 мин) охлаждали и осаждали при 2700 g в течение 3 мин при 0°С, трижды промывали ледяной дистиллированной водой. Промытые клетки суспендировали в 10 мМ К-фосфатном буфере, pH 5.5 из расчета 0.5 г (сырой вес) в 1 мл. Суспензию клеток переносили в пробирку с плоским дном, которую помещали в баню со льдом и преин-кубировали, интенсивно перемешивая на магнитной мешалке вплоть до измерения дыхания. Эмпирически было найдено, что максимальная скорость окисления достигается после преинкубации в течение 9-11 ч для сукцината, в течение 10-16 ч - для цитрата и 1-4 ч - для пирувата.

Измерение дынания клеток. Дыхание клеток измеряли амперометрически в термостатируемой ячейке с закрытым кислородным электродом [15] при 30°С в средах инкубации, содержащих 50 мМ К-фосфатный (pH 5.5 или 6.5), 50 мМ Na-фосфат-ный (pH 4.5, 5.5, 6.5 или 7.5), 50 мМ трис-фосфат-ный буфер (pH 5.5 или 6.5).

Представление результатов. Стационарные скорости окисления субстратов клетками устанавливалась в течение 1-3 мин и оставались на этом уровне в течение получаса [12]. Это позволяло определить зависимость скорости дыхания от концентрации субстратов или ингибиторов (не влияющих на эндогенное дыхание) в одной оксиметриче-ской кривой, поэтому разброс указан не на графиках, описывающих результаты преобразования этой оксиметрической кривой, а только для концентраций ингибитора, вызывающих 50% эффект (/50) и 99% эффект (I99), К, Км и Vmax, полученных в независимых экспериментах. При построении зависимости скорости окисления экзогенных субстратов от концентрации эффекторов из совокупной скорости окисления вычитали величину эндогенного дыхания (ve).

Определение доступной для 0-пальмитоил-£-ма-лата гидрофобной фазы дрожжевой клетки осуществляли по методике [16] в тех же условиях, в

которых исследовали эффект соединения на дыхание клеток.

Реактивы. В работе использовали Б(+)-глюко-зу моногидрат ("Merk"), дрожжевой экстракт и среду YNB без аминокислот и сульфата аммония ("Difco Laboratories", США), протонофор - карбонилцианид-(4-фторметокси)-фенилгидразон (FCCP) ("Ald-rich"), NaOH ("Fluka"), аспарагин ("Reanal", Венгрия) и отечественные препараты: KH2P04 и KOH квалификации ос.ч. Янтарную и лимонную кислоты, пируват, цитрат и сукцинат натрия ("Реахим") дополнительно перекристаллизовывали. Препараты 0-пальмитоил-£-малата и 2-ундецилмалона-та синтезировали в нашей лаборатории. Нерастворимые в воде реактивы растворяли в диметилсуль-фоксиде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первым шагом при решениии поставленных задач было выяснение способности 0-пальмито-ил-£-малата и 2-ундецилмалоната проникать в клетку. Эти амфифильные соединения ингибиро-вали окисление сукцината как клетками дрожжей, так и препаратами дрожжевых митохондрий [4]. Следовательно, они могут рассматриваться как специфические ингибиторы транспорта субстратов через плазмалемму только в том случае, если они не проникают в клетку (см. рис. 1). Ранее нами была показана непроницаемость плазматической мембраны для амфифильного соединения 0-паль-митоил-£-малата при кратковременной (2 мин) инкубации клеток с ним [4, 16]. Предстояло выяснить, способен ли 0-пальмитоил-£-малат проникать через плазмалемму за 20-30 мин инкубации (средняя продолжительность измерения скорости окисления клетками субстратов в присутствии ингибиторов в наших опытах).

В К-фосфатном буфере (pH 5.5) при 30°C доля мембран дрожжей, доступных для 0-пальмитоил-L-малата, и при кратковременной, и при длительной преинкубации была одинаковой (в среднем 0.365 ± 0.023). Если бы ингибитор проникал медленно, то доля недоступного гидрофобного объема уменьшалась бы при длительной преинкубации. По-видимому, 36.5% этого соединения оставалось за пределами клетки (в клеточной стенке и внешнем лепестке плазмалеммы). Две трети мембран (0.635) продолжали оставаться недоступными для 0-пальмитоил-£-малата. Это послужило основанием для использования в наших опытах этого непроникающего в цитоплазму ингибитора транспорта субстратов через плазмалемму.

Протонофор FCCP увеличивал скорость окисления глюкозы клетками S. cerevisiae (рис. 2а, кривая 1), время установления стационарной скорости не превышало 1 мин (не показано). Это независимое свидетельство быстрого проникновения FCCP

в клетку к митохондриям в наших условиях. В отличие от глюкозы, окисление которой активировалось БССР, окисление пирувата дрожжевыми клетками ингибировалось разобщителем с /50, примерно в 5 раз ниже концентрации эффектора, необходимой для полумаксимальной активации (А50) им окисления глюкозы (соответственно 0.21 и 1.0 мкМ, см. рис. 2а, кривые 3 и 1). Для протонофо-ра 8Б-6847 с другой химической структурой (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиденмалононит-рила) получили сходное соотношение А50//50, равное 4.1. Результаты согласуются с прямыми оценками соотношения концентраций протонофора СССР (карбонилцианид (4-хлорметокси)-фенил-гидразона), необходимых для деэнергизации различных сопрягающих мембран дышащих клеток 8. еегвУ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком