научная статья по теме ДИМЕРНЫЕ БИСБЕНЗИМИДАЗОЛЬНЫЕ КРАСИТЕЛИ НА ОСНОВЕ HOECHST 33258 – НОВЫЕ ДНК-СПЕЦИФИЧНЫЕ ФЛУОРОХРОМЫ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА И РАСТЕНИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «ДИМЕРНЫЕ БИСБЕНЗИМИДАЗОЛЬНЫЕ КРАСИТЕЛИ НА ОСНОВЕ HOECHST 33258 – НОВЫЕ ДНК-СПЕЦИФИЧНЫЕ ФЛУОРОХРОМЫ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА И РАСТЕНИЙ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 173-180

УДК 575.853.3:576.316.7

ДИМЕРНЫЕ БИСБЕНЗИМИДАЗОЛЬНЫЕ КРАСИТЕЛИ НА ОСНОВЕ HOECHST 33258 - НОВЫЕ ДНК-СПЕЦИФИЧНЫЕ ФЛУОРОХРОМЫ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА И РАСТЕНИЙ

© 2008 г. К. В. Попов, Е. И. Егорова, Ä. Ä. Иванов, Ä. В. Громыко, Ä. Л. Жузе, Н. Л. Большева, О. Ю. Юркевич, О. В. Муравенко, Ä. В. Зеленин

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, Москва, 119991, ул. Вавилова, 32;

электронная почта: azel@eimb.ru Поступила в редакцию 17.01.2008 г.

Изучена возможность применения 10 новых флуоресцентных красителей для дифференциального окрашивания хромосом. Большая часть исследованных соединений представляет собой димерные производные красителя Hoechst 33258. Соединения различаются как размерами линкера, соединяющего бисбензимидазольные мотивы, так и модификациями самих мотивов. Специфичность флуоро-хромов в отношении хроматина проверяли путем окрашивания фиксированных препаратов фибро-бластов человека. Отобраны четыре соединения (DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18)), придававшие яркую флуоресценцию хроматину при возбуждении в ультрафиолетовой области спектра (к = 365 нм) и не вызывавшие флуоресценции ядер или цитоплазмы при возбуждении синим или зеленым светом. Эти свойства красителей необходимы для окрашивания хромосом после проведения процедуры многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ. Красители DB(8) и DB(18) проявили меньшую скорость обесцвечивания в сравнении с более яркими, но менее стабильными красителями DB(7), DB(17), Hoechst 33258 и DAPI. Способность придавать хромосомам дифференциальную исчерченность (бэндинг) определяли на метафазных хромосомах человека. При обработке каждым из четырех отобранных соединений обнаружен флуоресцентный бэндинг, аналогичный выявляемому DAPI (Q-бэндинг). Рисунок после окраски соединениями DB(8) и DB(17) был более контрастным, чем после окраски DAPI. При окрашивании хромосомных препаратов льна (Linum grandiflorum L.) соединениями DB(7), DB(8), DB(17), DB(18) выявлялся рисунок, подобный таковому при С- и DAPI-дифференциальному окрашиванию. Не выявлено различий в характере окрашивания хромосом льна тестируемыми соединениями.

Результаты проведенного анализа в сочетании с данными о высокой ДНК-специфичности бис-ли-гандов дают основания предполагать перспективность использования новых АТ-специфичных флу-рохромов DB (8) и DB (17) в исследовании хромосом человека и растений.

ДНК-специфичные флуоресцентные красители (флуорохромы) широко используются в моле-кулярно-биологических и цитогенетических исследованиях ДНК, хроматина и хромосом [1-6]. Начало их применения в цитогенетике человека восходит к работам выдающегося шведского цито-биофизика Торборна Касперсона и его сотрудников [7-10], которые показали, что при обработке цитологических препаратов флуоресцирующими аминопроизводными акридина (акрихином и акрихин-ипритом) хромосомы приобретают четко выраженную поперечную исчерченность, получившую название О-бэндинга (от ОшпасИйпе - акрихин). Расположение флуоресцентных О-бэндов оказалось высокоспецифичным для отдельных хромосом, что позволило осуществить идентификацию всех хромосом человека [9]. Уже к 1971 г. была разработана и принята известная Парижская номенклатура хромосом человека [11], а вскоре были опубликованы хромосомные атласы [2].

В последующие годы фронт работ в этом направлении резко расширился, что привело к разра-

ботке обширного комплекса методов изучения хромосом, послужившего основой для создания совершенно новой области цитогенетики [3, 5].

Вскоре после публикации первых работ Касперсона было установлено [12], что в основе феномена Q-бэндинга лежит усиление флуоресценции акрихина при связывании с АТ-богатыми участками двухцепочечной ДНК (дцДНК). Этот факт хорошо согласуется с известной обогащенностью ге-терохроматина АТ-последовательностями [13, 14]. Однако сам акрихин связывается с дцДНК независимо от ее нуклеотидной последовательности, поэтому он не может быть причислен к АТ-специ-фичным лигандам. К числу последних относятся высокоэффективные флуорохромы Hoechst 33258 и DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол), специфически связывающиеся только с АТ-последовательностями дцДНК и придающие хромосомам яркий и четкий Q-бэндинг [15-17]. По ряду причин (высокая АТ-специфичность и эффективность флуоресценции, а также спектральные характеристики, позволяющие комбинировать их с другими

флурохромами) они вытеснили из практики акрихин.

Были обнаружены альтернативные флуоро-хромы, определяющие избирательную флуоресценцию участков хромосом, обогащенных GC-по-следовательностями [15, 16, 18, 19]. Это, в первую очередь, антибиотики митромициновой группы (оливомицин, митромицин и хромомицин), а также 7-аминоактиномицин D [20]. Картина флуоресценции хромосом, возникающая при использовании этих флуорохромов, отличается от Q-бэндинга. Они используются для решения ряда специальных задач, часто в сочетании с АТ-специфичными ли-гандами.

Интерес к лигандам, специфично связывающимся с дцДНК, вызван в немалой степени перспективой их применения в качестве противоопухолевых и противовирусных препаратов [21, 22]. Работы в этом направлении в течение ряда лет проводятся в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН [23, 24]. В ходе этих исследований осуществлен синтез новых высокоспецифичных флуоресцентных лигандов - димер-ных бисбензимидазолов (DB), узнающих два сайта из трех или четырех АТ-пар - (A/T)„-NN-(A/T)„ (где n = 3 или 4) и накрывающих при этом примерно один виток двойной спирали ДНК [25, 26]. При создании этих соединений в качестве исходной структуры был выбран АТ-специфичный краситель Hoechst 33258. Методами компьютерного моделирования сконструированы и затем синтезированы восемь DB и два аналога Hoechst 33258 (HA(10) и HA(10a)) [24, 27, 28].

Изучены спектральные характеристики этих красителей и установлено, что в результате их вза-

имодействия с дцДНК происходят характерные изменения их свойств, свидетельствующие об образовании комплексов при их локализации в узкой бороздке B-формы ДНК [24, 28, 29]. Обнаружено, что интенсивность флуоресценции DB в присутствии дцДНК увеличивается более чем на порядок, у соединения DB(17) - более чем в 20 раз [28]. В предварительных цитологических экспериментах выявлена перспективность использования таких флуорохромов для окрашивания хромосом [26, 27].

Целью данной работы было детальное изучение возможности и целесообразности применения новых производных Hoechst 33258 в цитогенетиче-ских исследованиях человека и растений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследуемые соединения. В данной работе была изучена способность 10 синтезированных ранее соединений специфично окрашивать хроматин и хромосомы. В качестве исходной молекулы была выбрана молекула флуоресцентного красителя Hoechst 33258 - производного бисбензимидазола.

Структура Hoechst 33258

Восемь соединений представляют собой димер-ные бисбензимидазолы (DB). Два соединения -НА(10) и НА(10а) - аналоги Hoechst 33258.

X

Nr rYn N N

H H

H

X

DB(4) R = PhO-(CH2)5-OPh; DB(5) R = PhO-(CH2)7-OPh;

DB(6) R = PhO-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2-OPh; X = CONH-(CH2)3-N(CH3)2

DB(7) R = CH2NHCO-(CH2)3-CONHCH2; DB(8) R = CH2NHCO-(CH2)4-CONHCH2;

DB(17) R = CH2NHCO-(CH2)5-CONHCH2; DB(18) R =CH2NHCO-(CH2)7-CONHCH2;

DB(9) R = CH2NHCO-(CH2)n-CONHCH2; X = HN NCH3

HA(10)

nh2

HA(10a)

Приготовление препаратов фиксированных клеток линии MRC-5. Клетки фибробластов линии MRC-5 эмбрионального легкого человека культивировали по стандартной методике в чашках Петри ("Nunc", США) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Клетки высаживали на покровные стекла размером 15 х 15 мм. При достижении монослоя клетки фиксировали смесью метанол : ледяная уксусная кислота = 3 : 1 (v/v), затем высушивали на воздухе и хранили при комнатной температуре.

Приготовление хромосомным препаратов из клеток линии MRC-5. Для накопления клеток в стадии метафазы в культуральную среду на 1 ч вводили колцемид (0.1 мкг/мл) ("Serva", США), после чего проводили обработку гипотоническим раствором 0.075 М KCl при 37°С в течение 15 мин. Смывали слабо прикрепленные клетки. Суспензию клеток фиксировали смесью метанол : ледяная уксусная кислота = 3 : 1. Для приготовления хромосомных препаратов клеточную суспензию раскапывали на охлажденные предметные стекла [2].

Окрашивание препаратов. Для окрашивания и заключения препаратов готовили среду, содержащую 70% глицерина, 10 мМ трис-HCl (pH 7.4), 15 мМ Na2SO3 в деионизованной воде.

Для исследования специфичности окраски хроматина клеточных ядер препараты фиксированных клеток MRC-5 помещали в 1 мкМ растворы красителей в среде для заключения. Препараты метафазных хромосом клеток линии MRC-5 и льна, а также препараты фиксированных клеток MRC-5 для определения динамики обесцвечивания флуоресцентной окраски окрашивали в течение 30 мин флуорохромами в концентрации 0.2 мкМ, разведенными в PBS, в темноте. Препараты промывали в PBS 3 раза по 5 мин, а затем в деионизованной воде, после чего помещали в среду для заключения препаратов. Во всех случаях готовые препараты окантовывали резиновым клеем и исследовали на следующий день.

Построение профиля яркости флуоресценции вдоль хромосом. Для сравнения контрастности рисунков окраски, выявляемых различными красителями, строили профили яркости флуоресценции вдоль хромосом. Для каждого из соединений DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18), DAPI и Hoechst 33258 выбирали изображения хромосом, находящихся на средней степени спирализации. Профили яркости флуоресценции строили для хромосом групп 1, 2, 17 и 22 с помощью программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). С использованием подпрограммы Straighten проводили выпрямление изображений индивидуальных хромосом. По спрямленным изображениям хромосом функцией Plot profile строили профили яркости вдоль осей хромосом. Более высокая контрастность изображений соот-

ветствует более резким границам сегментов на профиле яркости и их большему числу.

Исследование динамики выгорания флуоресцентных красителей. Для сравнения динамики обесцвечивания флуоресцентной окраски со

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком